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Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 1639 (2023) Citar este artículo

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La síntesis total de cuatro nuevos derivados de dihidronarciclasina de anillo A monometoxi e hidroxilo sustituidos permitió la identificación del derivado de 7-hidroxilo como un agente antiviral potente y selectivo dirigido al SARSCoV-2 y al HSV-1. La concentración de esta pequeña molécula que inhibía la infección por HSV-1 en un 50 % (IC50), determinada mediante el uso de organoides de órganos cerebrales derivados de células madre pluripotentes inducidas (iPCS) generados a partir de dos líneas de iPCS, se estimó en 0,504 µM y 0,209 µM. No se observó una reducción significativa en la viabilidad de los organoides en concentraciones de hasta 50 mM. Los análisis de expresión genómica revelaron un efecto significativo sobre la inmunidad innata de la célula huésped, revelando la activación de la respuesta integrada al estrés a través de la regulación positiva de la quinasa PERK, la fosforilación del factor de iniciación eucariótico 2α (eIF2α) y el IFN tipo I, como factores que potencian múltiples mecanismos de defensa del huésped contra virus. infección. Después de la infección de ojos de ratón con HSV-1, el tratamiento con el compuesto redujo drásticamente la eliminación de HSV-1 in vivo.

Los productos naturales siguen ocupando un papel central en el descubrimiento de fármacos1,2,3,4, una tradición que se evidencia en los recientes esfuerzos en la identificación de nuevas pistas contra el coronavirus asociado al SARSCoV-23. Las terapias actualmente aprobadas y en investigación son agentes reutilizados o diseñados que se dirigen a proteínas virales clave, como la proteasa o la inhibición de la ARN polimerasa4. Los alcaloides aislados de varios miembros de la familia de plantas Amaryllidaceae5 tienen un amplio potencial farmacológico en vista de sus propiedades anticancerígenas6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16, antivirales17,18,19,20,21, 22 y actividades de acetilcolinesterasa que han demostrado. La actividad antiviral de la narciclasina (1) y de una amplia gama de alcaloides (Fig. 1) de esta clase se informó hace tres décadas17. También se ha informado recientemente sobre la potente actividad antiviral de la 1-desoxipancratistatina (2a) y la trans-dihidrolicoricidina (2b)23 contra virus de ADN como el herpes (HSV-1, VZV) y virus de ARN, incluido el Zika (ZIKV)19,20,24. También se ha demostrado que el alcaloide relacionado licorina (3) exhibe una replicación significativa del coronavirus asociado al SARS21. El mecanismo de acción responsable del espectro de actividad antiviral observado en la clase de narciclasina no está claro. La inhibición de la biosíntesis de proteínas mediante la interacción con el factor de elongación de la traducción 1A de eucarióticos humanos (eEF1A) ha sido implicada previamente y recientemente revisada22. La actividad de amplio espectro no sólo contra el ADN, sino también contra los virus de ARN es intrigante y puede implicar la activación de un mecanismo de defensa del huésped en lugar de un objetivo viral específico. Imaginamos que la elaboración de un agente antiviral potente y selectivo serviría como una valiosa sonda biológica necesaria para iluminar los fundamentos mecanicistas responsables. Comprender este mecanismo se convirtió en una prioridad, ya que su regulación positiva podría proporcionar una defensa sólida independiente de las proteínas virales que mutan rápidamente, como las observadas en el SARSCoV2.

(A) Estructura de los componentes naturales de amaryllidaceae con potente actividad antiviral, narciclasina (1), 1-desoxipancratistatina (trans-dihidronarciclasina) (2a), trans-dihidrolicoricidina (2b), licorina (3) y el análogo sintético inactivo 10b-aza ( 4). (B) Los nuevos análogos de trans-dihidronarciclasina 5–8 y la retrosíntesis propuesta a través del derivado de ciclohexano 9, que podría derivarse del derivado de cinamaldehído 10 y azidoacetona 11.

En este documento describimos la síntesis asimétrica de cuatro nuevos análogos de dihidronarciclasina con C9-OMe (5), C9-OH (6), C7-OMe (7) y C7-OH (8) monosustituidos en el anillo A, que contienen la síntesis completa. anillo-C funcionalizado (Fig. 2). Los estudios iniciales de actividad antiviral condujeron a la identificación del análogo 7-hidroxilo 8, solo, como el análogo estructuralmente mínimo que demuestra actividad antiviral contra HSV-1. También se descubrió que el compuesto 8 exhibe una actividad antiviral potente y selectiva contra el coronavirus SARSCoV-2. Informamos los hallazgos iniciales sobre un objetivo biológico y el mecanismo de acción del compuesto 8 consistente con la actividad observada contra virus de ADN y ARN. Demostramos que el compuesto 8 activa la respuesta integrada al estrés (ISR) de los eucariotas y la red de señalización resultante, induciendo la autofagia. El compuesto 8 también regula positivamente la vía de señalización de las sirtuinas, con activación de la inmunidad innata. La regulación positiva de estas defensas antivirales sinérgicas en la célula huésped explica la actividad antiviral de amplio espectro observada. Es importante destacar que estos procesos no dependen de interacciones con proteínas estructurales virales altamente mutables y objetivos no estructurales como las proteasas, por lo que el compuesto 8 representa una ventaja importante hacia el avance de un agente antiviral estable y de amplio espectro. El compuesto 8 también demostró una potente actividad anti-HSV-1 in vivo en un modelo de ratón.

(A) Síntesis de triacetatos truncados del anillo A 16 y 17: carga de Pd/C y tiempo (a) 1. (CH3CH2O)2CHCH2P(CH2CH2CH3)3Br, NaH, THF; 2. HCl 1 M, temperatura ambiente, 95 %; (b) 11, CH2Cl2, (R)-difenilprolinol TMS éter, quinidina, -10 °C—TA, 55 %; (C) H2, Pd% 15 mol/C MeOH, 32 h, temperatura ambiente, 88%; (d) 1. DIPEA, MsCl, CH2Cl2, 10 h, TA, 2. Li(tBuO)3AlH, THF, 20 h, 0 °C—TA, 95%; (e) 1. mCPBA, NaHCO3, CH2Cl2, 24 h, temperatura ambiente; 2. NaBz/H2O, 16 h, 90–95 °C; 3. Ac2O, Py, 16 h, TA, en 3 pasos 77 %; (f) Tf2O, DMAP, CH2Cl2, 16 h, 0 °C—TA. (B) Formación del dímero no simétrico 18: (C′) H2, 10 % molar de Pd/C, DMDC, MeOH, 16 h, RT.

Anteriormente hemos informado sobre la síntesis total y los estudios antivirales de 1-desoxipancratistatina (2a) y trans-dihidrolicoricidina (2b)23,24. En este trabajo, se investigó la síntesis de diversas modificaciones del anillo C hidroxilado y sus actividades antivirales. Por ejemplo, el epímero C3 de 2b25, entre otros análogos, así como el análogo aza 426 completamente funcionalizado demostraron estar totalmente desprovistos de actividad antiviral. Hasta la fecha, el compuesto 2b parece ser la estructura mínima que exhibe una potente actividad antiviral, actividad que se mejora significativamente mediante la adición del grupo hidroxilo C7 presente en el compuesto 2a17. Otras modificaciones del anillo C como medio para optimizar la potencia y la selectividad antivirales parecen infructuosas. Estos resultados centraron nuestra atención en los sustituyentes del anillo A como el último fragmento restante disponible para modificación. Todos los análogos investigados para determinar la actividad viral del ARN poseen el sustituyente 8,9-metilendioxi fusionado al anillo A22. Sólo un estudio previo ha investigado posiciones alternativas de hidroxilo del anillo A. Alonso y su compañero de trabajo informaron sobre la síntesis del análogo 8-hidroxilo, que mostró una actividad anticancerígena significativamente reducida, aunque su actividad antiviral no fue investigada27. Para delinear las contribuciones de un único sustituyente del grupo hidroxilo o metoxi en el anillo A a la actividad antiviral, modificamos nuestra síntesis original de 1-desoxipancratistatina (2a) y trans-dihidrolicoricidina (2b), a partir del metaanisaldehído (12). .

La síntesis de los compuestos objetivo 5–8 se logró mediante una estrategia convergente-divergente a través del intermedio común 15 (Fig. 2A) con modificaciones significativas a nuestro protocolo sintético publicado23. El 3-metoxibenzaldehído 12 disponible comercialmente se sometió a una homologación de aldehído de dos carbonos con alquenal usando un reactivo de Wittig funcionalizado con dietil acetal, produciendo el 3-metoxicinamaldehído 10 con un rendimiento del 95%. La secuencia de Michael-aldol [3 + 3] por etapas organocatalítica asimétrica mediada por ion iminio de 10 con azidoacetona 11 se desarrolló suavemente utilizando el (R)-difenilprolinol-trimetilsilil éter y catalizadores de quinidina, proporcionando el cicloaducto 9 con un rendimiento aislado del 55 %. La hidrogenación del grupo funcional azido de 9 con Pd al 10%/C en presencia de dicarbonato de dimetilo dio la deseada ciclohexanona 13 protegida con metoxicarbonilo, así como un subproducto menor, que resultó ser el dímero monoaromatizado estructuralmente interesante 18 (Fig. 2B). Para mejorar la selectividad que favorece a 13, la dilución (0,1 M) y el aumento del tiempo de reacción permitieron el aislamiento de la ciclohexanona 13 protegida con metoxicarbonilo con un rendimiento aislado del 75 % junto con el producto secundario 18 con un rendimiento aislado del 10 %. Curiosamente, el aumento de la carga de catalizador hasta el 15%, en condiciones de reacción idénticas, condujo sólo al compuesto 13 deseado. Este producto secundario menor indica que la reducción anticipada de la azida 9 fue exitosa, la aminocetona libre luego sufre una intensificación. dimerización in situ seguida de deshidratación y aromatización de un anillo (quizás a través de un intermediario enamina) que produce 18. Se encontró que el carbamato 13 y su enantiómero ent-13, preparados de manera idéntica usando (S)-difenilprolinol-trimetilsilil éter) eran > 99 %. y > 98 % de exceso enantiomérico (ee) respectivamente (resolución inicial) usando HPLC quiral (columna AD-H). La deshidratación de 13 a través del mesilato formado in situ y la reducción inmediata de la cetona usando el voluminoso hidruro de litio tri-terc-butoxialuminio produjo el alcohol ecuatorial 14 exclusivamente con un rendimiento del 95% para los dos pasos. La epoxidación del alcohol alílico 14 produce ambos epóxidos diastereoméricos que se abren estereoespecíficamente mediante un ataque axial exclusivo utilizando benzoato de sodio en agua, produciendo el triol 2,3-diaxial-4-ecuatorial, que se acetiló con Ac2O en presencia de piridina para dar el triacetato 15. con un rendimiento global del 77% a partir de 13. El anillo de fenantridona se cerró empleando la modificación de Banwell de la reacción de Bischler-Napieralski28, dando los productos tricíclicos regioisoméricos 16 y 17. Los compuestos 16 y 17 se resolvieron claramente en sílice y se separaron mediante cromatografía ultrarrápida de elución en gradiente a partir de 100% diclorometano, produciendo 16 (principal) y 17 (menor) en rendimientos aislados del 51% y 15% respectivamente. La escisión selectiva del éter metílico con 9 átomos de carbono en 16 resultó problemática. Los intentos de escisión utilizando reactivos estándar como TMSI o BBr3 dieron como resultado mezclas de productos, y el uso de BCl3-dimetilsulfuro dio como resultado la escisión del éster. Sin embargo, se descubrió que el uso de AlCl3 en presencia del catalizador de transferencia de fase yoduro de tetrabutilamonio (1:3) fue exitoso, siguiendo un protocolo desarrollado por Steglich y colaboradores29. Este procedimiento proporcionó el compuesto fenólico 19 con un rendimiento del 88%. Se repitieron las mismas condiciones de reacción para la escisión del éter metílico C7 17, que también proporcionó el fenol desmetilado 20 con un rendimiento del 89 %. La saponificación global de los grupos acetato se logró fácilmente en los compuestos 16, 19, 17 y 20 usando K2CO3 y metanol acuoso, produciendo finalmente los compuestos requeridos 5, 6, 7 y 8 respectivamente (Fig. 3).

Síntesis de derivados de trans-dihidronarciclasina truncados del anillo A (5–8). (a) K2CO3, MeOH, 95%; (b) AlCl3/TBAI, CH2Cl2:C6H6 (1:1) 88%; (C) K2CO3, MeOH, 94%; (d) K2CO3, MeOH, 96%; (e) AlCl3/TBAI, CH2Cl2:C6H6 (1:1) 89%; (f) K2CO3, MeOH, 96%.

Recientemente demostramos que la trans-dihidrolicoricidina (2b) inhibe la replicación del HSV-1 de manera más eficaz que el aciclovir (ACV) y previene la reactivación del HSV-1 desde la latencia en un modelo de ratón ex vivo20,25. Además, se demostró que 2b exhibe una potencia moderada contra cepas de HSV-1 que se han reportado como resistentes al ACV, como la cepa tk- de HSV-1 que carece de actividad timidina quinasa30, y la cepa PAAv que ha desarrollado mutaciones en virus. ADN polimerasa tras incubación con ácido fosfonoacético31. También se demostró la actividad antiviral de 2b contra otros virus de ADN (HSV-1, HCMV, HBV) y virus de ARN (VHC, cepas de ZIKV FSS-13025 y PE-243)20. Se observó una toxicidad ligeramente mayor para 2b en comparación con aciclovir en fibroblastos y hepatocitos, mientras que se observó una toxicidad menor en células progenitoras neurales (NPC) derivadas de iPSC.

La actividad antiviral de los nuevos derivados monohidroxilo y metoxi 5, 6, 7 y 8 se probó inicialmente en dos líneas de células precursoras neurales (NPC) y se comparó con el aciclovir, el tratamiento "estándar de oro" para las infecciones por HSV. Los NPC se utilizaron en esta pantalla inicial por dos razones; (i) la necesidad de emplear una plataforma compuesta por células del SNC, y (ii) la mayor susceptibilidad de los NPC al HSV-1 en comparación con las neuronas. Los NPC humanos se derivaron de iPSC como se describió anteriormente32. Los NPC se infectaron con una construcción HSV-1 (DualF) que expresaba una proteína fluorescente verde mejorada (EGFP) y una proteína fluorescente roja monomérica (RFP) bajo el control de los promotores virales ICP0 y glicoproteína C, respectivamente32, en una multiplicidad de infección (MOI). de 0,1, como se detalla en la sección Experimental B. La expresión de los genes indicadores fluorescentes EGFP y RFP se consideraron como sustitutos de la expresión de genes virales. Dos horas después de la infección, se retiraron los inóculos y las células se cultivaron en presencia de los análogos monometoxi/hidroxi descritos anteriormente a una concentración de 10 µM o ACV a 50 µM y se analizaron el día 3 después de la infección (pi). El análisis de citometría de flujo (FC) indicó que el compuesto 8 redujo el porcentaje de células EGFP+-RFP+ en 6,76 y 4,65 veces y en 01SD y 9001 NPC, respectivamente, en comparación con las células infectadas expuestas al vehículo (Fig. 4A). El compuesto 2b dio como resultado la mayor reducción de células fluorescentes (01SD: (8016 veces; 9001: 424 veces). Sorprendentemente, los análogos 5, 6 o 7 no mostraron actividad anti-HSV-1 (Fig. 4A). 5 también demostró ser incompletamente soluble en DMSO y, por lo tanto, no se consideró más a fondo. En concentraciones de hasta 50 μM, la viabilidad celular de los cultivos tratados con ACV y el compuesto 8 fue comparable (Fig. 4B). Por el contrario, se observó una reducción en la viabilidad celular en 2b. cultivos tratados a partir de 25 μM de acuerdo con la citotoxicidad discutida anteriormente para 2b. Una vez más, los compuestos 6 y 7 no mostraron actividad anti-HSV-1. Por lo tanto, la cuantificación de la infección viral y el análisis de la relación estructura-actividad basado en la viabilidad celular El uso de cultivos monocapa 2D NPC identificó el compuesto 8 como un nuevo fármaco anti-HSV-1 con una eficacia comparable o superior al ACV. La potencia antiviral de 2b y 8, y la selectividad demostrada por 8 solo, revela un farmacóforo privilegiado en el compuesto 8, único en el mayor refinamiento de la actividad antiviral selectiva que se observa.

Los compuestos 2b y 8 inhiben el HSV-1 en NPC derivados de iPSC humanas en diferentes grados. (A) Análisis de citometría de flujo (FC) de líneas NPC infectadas y no infectadas 01SD y 9001 en presencia o ausencia de ACV, 2b y sus derivados 6, 7 y 8 utilizando una construcción HSV-1 diseñada DualF, que expresa EGFP a partir de un gen IE promotor y RFP de un promotor génico tardío. Los NPC se infectaron con una multiplicidad de infección de 0,1. Los compuestos antes mencionados se agregaron a las dos horas pi y los cultivos se analizaron el día 3 pi. Se indican las fracciones de células que muestran fluorescencia del color apropiado. (B) FC evaluó la citotoxicidad de 2b, 8 y ACV en concentraciones variables en cultivos de 01SD NPC no infectados utilizando un tinte de viabilidad fijable. Los datos representan un promedio de seis experimentos independientes. Las barras de error representan desviaciones estándar. Se utilizó un análisis de varianza unidireccional (ANOVA) seguido de la prueba post-hoc de Bonferroni para comparar la reducción de células EGFP-RFP+ después del tratamiento de células infectadas con compuestos probados en comparación con el vehículo HSV-1 +: *P = 0,0124; **P<0,0001.

Aunque los cultivos clásicos en monocapa 2D facilitan los procesos de detección de fármacos, no recapitulan la arquitectura 3D ni el microambiente fisiológico de un tejido vivo. condiciones. Como consecuencia, es posible que los efectos de los fármacos en un microambiente 2D no reflejen con precisión los efectos de los fármacos in vivo. Cada vez hay más pruebas de que los cultivos tridimensionales aumentan la previsibilidad de la actividad farmacológica in vivo33. Así, se investigó la actividad inhibidora de 2b y sus derivados contra HSV-1 en una plataforma de cultivo 3D compuesta de organoides cerebrales. En la figura complementaria 1 se muestra una caracterización de los organoides diferenciadores. Los organoides cerebrales de catorce semanas de edad generados a partir de iPSC 9001 y 01SD se infectaron individualmente durante 2 h con el virus HSV-1 DualF (6000 pfu/organoide). Después de la infección, los organoides se cultivaron en presencia o ausencia de los compuestos probados (10 µM) o ACV (50 µM). En el día 3 pi, no se observó expresión de los genes indicadores EGFP y RFP en los organoides 9001 y 01SD infectados tratados con 2b y 8. Como se esperaba, el ACV también inhibió eficientemente la infección por HSV-1 (Fig. 5). Por el contrario, los derivados 6 y 7 no mostraron actividad anti-HSV-1 (Fig. 5). Estos resultados confirman la capacidad del nuevo análogo 8 por sí solo para inhibir la infección por HSV-1.

La eficacia anti-HSV-1 del compuesto 8 es comparable a la del 2b y el ACV en organoides del cerebro humano. Los organoides cerebrales de catorce semanas de edad generados a partir de las líneas iPSC 9001 y 01SD se infectaron individualmente con la construcción HSV-1 DualF (6000 ufp/organoide). Dos horas después de la infección, se retiraron los inóculos, los organoides se lavaron y cultivaron en presencia de los compuestos probados. La expresión de los genes fluorescentes EGFP y RFP se inspeccionó visualmente bajo un microscopio fluorescente el día 3 pi N = 3 para cada condición. Barra de escala: 50 μm.

A continuación, se determinó la concentración de 8 que inhibía la infección por HSV-1 en un 50% (IC50) en los organoides 9001 y 01SD. Se infectaron organoides cerebrales de dieciséis semanas de edad como se describió anteriormente y se expusieron después de 2 h a una concentración creciente de 8 que oscilaba entre 0,01 y 50 μM. En el día 3 pi, se investigó la CI50 de 8 midiendo la intensidad del gen indicador fluorescente EGFP (cuya expresión está bajo el control del promotor del gen temprano inmediato del HSV-1 ICP0) en los organoides infectados. La expresión de EGFP se utilizó como indicador de la expresión de genes virales durante las primeras etapas de la infección aguda por HSV-1. Se determinó que la CI50 del compuesto 8 era 0,504 µM en 9001 y 0,209 µM en organoides 01SD (Fig. 6A). No se observó una reducción significativa en la viabilidad de los organoides, determinada mediante el uso de calceína AM, en concentraciones de hasta 50 μM, lo que indica un amplio margen de seguridad en este ensayo (Fig. 6B).

Eficacia antiviral y citotoxicidad de 8 contra HSV-1 en organoides del cerebro humano. (A) Los organoides cerebrales 9001 y 01SD de dieciséis semanas de edad se infectaron individualmente con la construcción HSV-1 DualF (6000 ufp/organoide). Después de 2 h, se retiraron los inóculos y se agregaron 8 (799) a concentraciones variables (100 nM – 50 μM). La IC50 se estimó determinando la fluorescencia celular total corregida (CTCF) obtenida midiendo la fluorescencia de EGFP en organoides usando ImageJ y normalizando el fondo usando la ecuación CTCF = densidad integrada - (área del organoide × fluorescencia media de las lecturas de fondo). (B) La citotoxicidad de 8 sin infección por HSV-1 se evaluó utilizando calceína-AM. Se midió la fluorescencia de calceína-AM en cada organoide y se determinó CTCF como se describe anteriormente. Los datos representan un promedio de seis experimentos independientes. Las barras de error representan desviaciones estándar. Se utilizó un análisis de varianza unidireccional (ANOVA) seguido de una prueba post hoc utilizando la corrección de comparación múltiple de Tukey para comparar la viabilidad celular en diferentes concentraciones de fármaco. No se encontraron diferencias significativas en la viabilidad celular entre las condiciones. Barra de escala: 50 μm.

La actividad antiviral de los compuestos 2b y 8 del coronavirus SARS-CoV2 asociado a la COVID-19 en células Calu3 (ATCC, HTB-55) se evaluó de forma independiente en los Institutos Nacionales de Salud (NIH). Se determinó que el compuesto 2b exhibía una CI50 de 0,18 µM y una CC50 de 3,48 µM, lo que daba una selectividad terapéutica de 19. El nuevo análogo 8 demostró ser más potente y una selectividad ligeramente mejor, exhibiendo una CI50 de 0,09 µM y una CC50 de 1,92 µM. , dando una selectividad terapéutica de 20. El remdesivir de control positivo exhibió un valor de CI50 de 0,06 µM en este ensayo (Figura complementaria 3).

Dada la actividad observada en los virus de ADN y ARN, realizamos análisis de secuenciación de ARN en células huésped tratadas con alcaloides sintéticos para evaluar cambios en los niveles de transcripción con el objetivo de iluminar las vías operativas. Se incubaron células 02SF NPC no infectadas con 2b, 8, 6 (802) o 7 (718), (10 μM) durante 72 h. Después de la extracción, se analizaron las secuencias de ARN del huésped. Se expresaron un total de 12.433 genes humanos en TPM ≥ 5 en al menos una réplica de NPC no tratados. Cuando los NPC se incubaron con los compuestos 2b, 8, 6 o 7, la expresión de 7766 (62,5%), 7433 (59,8%), 256 (2,1%) y 33 (0,3%) genes de la célula huésped, respectivamente, fue significativamente mayor. alterado (FDR corregido p ≤ 0,05, expresión media máxima del grupo TPM ≥ 5). Utilizando RT-PCR cuantitativa, confirmamos alteraciones en los niveles de ARNm para cuatro genes seleccionados que fueron alterados significativamente por los compuestos 2b y 8 en los análisis de secuenciación de ARN (Figura complementaria 2).

El análisis de vías de ingenio (IPA) identificó vías canónicas que se alteraron significativamente cuando se incubaron hiPSC-NPC con 2b y 8. La significación estadística se calculó utilizando pruebas de probabilidad exacta de Fisher de cola derecha; las vías biológicas que mostraron un valor de p <0,05 se consideraron estadísticamente significativas. Las diez vías alteradas más significativamente se muestran en la Fig. 7. La vía de señalización del factor de iniciación eucariota 2 (EIF2) fue la más alterada (2b: puntuación z: − 2,857, valor p = 5,09E−39; 8: puntuación z: − 1,763, valor p = 2,43E−30). Los análisis de IPA también indicaron una regulación positiva neta en las vías de señalización de autofagia y sirtuina.

Las vías de los genes humanos se alteraron significativamente por 2b y 8. Los genes expresados diferencialmente (DEG) medidos comparando los NPC tratados con 2b y 8 versus los NPC tratados con vehículo se sometieron a un análisis de vías de ingenio (IPA). Se muestran las 10 vías principales que muestran la mayor significación estadística (valor p de la prueba exacta de Fisher). La activación (+ve z-score, barras naranjas) o la inhibición (-ve z-score, barras azules) de cada vía es una medida de los cambios en la expresión génica determinados experimentalmente informados en la literatura. La intensidad del color indica el grado de activación/inhibición. Los caminos sin un patrón de actividad están en gris. Las proporciones (cuadrado naranja encima de cada vía) representan el grado de superposición entre DEG y todos los miembros de una vía determinada. El eje Y a la derecha indica los valores de relación.

Estos resultados sugirieron inmediatamente la hipótesis de que los compuestos 2b y 8 pueden afectar la replicación viral al desencadenar la respuesta integrada al estrés (ISR), que, a su vez, podría bloquear la traducción del ARNm dependiente de la cápsula de metilo 5'34,35. Para probar esta hipótesis, investigamos la fosforilación de la subunidad α del factor de iniciación eucariota 2 (eIF2α ~ P) en la serina 51 en cultivos de NPC expuestos a los compuestos 2b y 8, y los comparamos con NPC no tratados o NPC tratados con el derivado 7, que no presenta ninguna actividad antiviral. De hecho, el análisis inmunocitoquímico demostró una mayor inmunorreactividad de eIF2α ~ P en los cultivos tratados con 2b y 8 (Fig. 8). Estos resultados confirman que la fosforilación de e1F2α está regulada positivamente y que la activación de la respuesta integrada al estrés (ISR) es uno de los principales mecanismos subyacentes a la actividad antiviral de estas pequeñas moléculas. El análisis de RNAseq también mostró que la fosforilación de la subunidad α del factor de iniciación eucariota 2 está mediada por la quinasa eIF2α EIF2KA3 (PKR-ER o PERK) en los cultivos tratados con 2b y 8 (Fig. 8). Por tanto, los datos de secuenciación de ARN son totalmente consistentes con la hipótesis de que 2b y 8 desencadenan una respuesta antiviral del huésped mediante la activación de un ISR.

Activación de la respuesta integrada al estrés en NPC tratados con 2b y 8. (A) Los NPC derivados de 9001 líneas iPSC se expusieron a los compuestos 7, 8 y 2b (10 μM). Después de 24 h, las células se fijaron y se tiñeron con un anticuerpo que detecta eIF2α fosforilado en Serina 51 (EIF2S1). Los núcleos se tiñeron con Hoechst 33342 y la fosforilación se evaluó mediante microscopía de fluorescencia. (B) La fluorescencia celular total corregida (CTCF) se obtuvo midiendo la fluorescencia EIF2S1 en células donde se podía detectar una señal fluorescente y normalizando el área celular usando la ecuación CTCF = densidad integrada - (área celular × fluorescencia media de las lecturas de fondo). Las barras de error son desviaciones estándar. Se utilizó un análisis de varianza unidireccional (ANOVA) seguido de la prueba post-hoc de Bonferroni para comparar CTCF entre las diferentes condiciones: ** (P = 0,0042); **** (P < 0,0001). (C, D) Regulación positiva de la quinasa EIF2A EIF2AK3 (C) y el factor de transcripción activado 4 (ATF4) (D) en NPC tratados con 2b y 8. Los cambios se calcularon a partir de los datos de RNA-seq descritos en la sección de métodos. (E) Mecanismo de acción propuesto de 2b y 8.

ISR actúa en el nivel de iniciación de la traducción para suprimir la síntesis global de proteínas (al tiempo que mejora la traducción de varias proteínas implicadas en la recuperación celular). La regulación negativa de la síntesis de proteínas virales inducida por ISR es un mecanismo de defensa antiviral eficaz. Además, la fosforilación de eIF2 conduce a una mayor síntesis del factor de transcripción activador 4 (ATF4), que luego se transporta al núcleo para transactivar genes necesarios para que la célula se adapte al estrés, como la autofagia36. En células infectadas por HSV-1. Las proteínas de autofagia se dirigen a componentes virales o viriones para la degradación lisosomal37. Además, la activación de la vía de las sirtuinas refuerza las propiedades antivirales. Curiosamente, se demostró que SIRT1, una desacilasa/mono-ADP ribosiltransferasa dependiente de NAD que puede inhibir el crecimiento de virus de ADN y ARN, está regulada positivamente (Figura complementaria 2). La regulación positiva de SIRT1 también puede contribuir a la actividad antiviral de amplio espectro observada con los compuestos 2b y 838,39.

La eficacia antiviral del compuesto 8 se investigó más a fondo y se confirmó en un modelo de ratón in vivo. Se infectaron los ojos de ratones suizos ND4 con HSV-1 después de una ligera escarificación corneal como se describe en la sección Materiales y métodos. Al mismo tiempo que se aplicó el virus, un grupo de ratones (n = 10) fue tratado con una solución 50 uM del compuesto 8 en DMSO y el otro grupo (n = 10) fue tratado con DMSO (vehículo). Los ojos se trataron con vehículo o con el compuesto 8 cada día durante 4 días. Se tomaron muestras de los ojos diariamente y se evaluó la eliminación del virus infeccioso mediante un ensayo de placa estándar. Como se muestra en la Fig. 9, los ojos tratados con el compuesto 8 redujeron drásticamente la producción de virus infecciosos en las lágrimas en comparación con los ojos tratados con vehículo. El título de virus infeccioso en los ojos tratados con vehículo alcanzó su punto máximo el día 2 después de la infección, mientras que el pico se retrasó un día en el grupo de tratamiento 8, reduciéndose casi tres veces.

Actividad antiviral in vivo. Se infectaron ratones suizos ND4 mediante escarificación corneal con 1 × 105 ufp de HSV-1 cepa 17syn+. Se tomaron muestras de los ojos diariamente durante 4 días y se analizó la presencia de virus infecciosos mediante un ensayo de placa estándar. El compuesto 8 (código R799) reduce drásticamente la eliminación de HSV-1 en el ojo del ratón.

En conclusión, informamos el desarrollo y la actividad antiviral de un nuevo alcaloide sintético 8 de anillo A truncado contra HSV-1 y SARSCoV2. Las investigaciones mecanicistas demuestran la activación de las defensas del huésped mediante la regulación positiva de la vía integrada de respuesta al estrés que da como resultado la autofagia. Este trabajo demuestra la aplicación de un agente antiviral de molécula pequeña para inducir inmunidad innata mediante la activación de la quinasa EIF2 (EIF2AK3 o PERK) como mecanismo para la regulación positiva del ISR. La regulación positiva de la maquinaria de defensa de la célula huésped después de una infección viral con un prototipo terapéutico como el 8 revela un paradigma atractivo para el desarrollo de un agente antiviral de amplio espectro con una menor propensión prevista a la resistencia a los medicamentos antivirales. La capacidad de activar la inmunidad antiviral innata a través de la estimulación con interferón tipo I y/o III se ha descrito para lípidos de moléculas pequeñas como los ácidos biliares40, los retinoides41 y el agente antiviral tópico imiquimod42, que implican vías reguladoras complejas. Antes de este trabajo, se desconocía la contribución de los oxisustituyentes del anillo A de los alcaloides de tipo narciclasina a la actividad antiviral22. Si bien se conocía la capacidad de esta clase de alcaloide para inhibir la biosíntesis de proteínas a nivel ribosomal, el objetivo y el mecanismo no estaban claros22. Estudios anteriores han implicado la inhibición de la biosíntesis de proteínas de la célula huésped a través del factor de elongación de la traducción 1A. Se ha demostrado que el complejo depsipéptido plitidepsina derivado de la ascidia marina tiene actividad anti SARSCoV2 mediante la inhibición del factor de elongación eEF1A43. El presente trabajo indica que los alcaloides de tipo narciclasina truncados también actúan significativamente aguas arriba de esto, y que la inhibición de la traducción es en parte un evento consecuente mediado a través de P-eIF2-alfa. El perfil de secuenciación de ARN proporciona una firma molecular que permite el desarrollo de un agente antiviral selectivo, ya que la activación excesiva y prolongada del ISR puede provocar la muerte celular programada. Este trabajo identifica la fosforilación regulada positivamente del huésped eIF2α como un objetivo preciso consistente con la actividad biológica conocida de estos alcaloides. La activación modulada del ISR puede conducir a una disminución de la expresión de proteínas y a la autofagia, lo que da como resultado una potente actividad antiviral de manera selectiva.

Los productos químicos y disolventes se compraron de Acros, Aldrich, JT Baker, Caldeon, Solvay y Fluka y se utilizaron tal como se recibieron con las excepciones que se indican a continuación. Los disolventes deuterados se obtuvieron de ACP Chemicals, Toronto, Canadá. Se destilaron tetrahidrofurano (THF), éter dietílico (Et2O) y tolueno a partir de sodio/benzofenona en una atmósfera de nitrógeno seco; se destiló diclorometano (CH2Cl2) a partir de hidruro de calcio en una atmósfera de nitrógeno seco; se destiló metanol (MeOH) a partir de virutas de magnesio en una atmósfera de nitrógeno seco; se destilaron trietilamina (NEt3), N,N-diisopropiletilamina (base de Hünig) y piridina a partir de hidróxido de potasio en una atmósfera de nitrógeno seco; Se obtuvo hidruro de sodio (NaH) sólido mediante filtración y lavado con n-hexanos.

Todas las reacciones no acuosas se realizaron en matraces de fondo redondo secados a la llama o en viales de 1,5 dram de color ámbar no secados a la llama. Las reacciones se agitaron magnéticamente y se controlaron mediante cromatografía de capa fina (TLC), a menos que se indique lo contrario. La TLC se realizó en placas de aluminio TLC Macherey-Nagel gel de sílice 60 F254 y se visualizó con extinción de fluorescencia UV y tinciones con permanganato de potasio (KMnO4) o 2,4-dinitrofenilhidrazina o p-anisaldehído1. Las concentraciones a presión reducida se realizaron mediante evaporación rotatoria a 40 °C a la presión adecuada, a menos que se indique lo contrario. La purificación cromatográfica en columna se realizó como cromatografía en columna ultrarrápida con una presión de 0,3 a 0,5 bar utilizando gel de sílice Silicycle (40–63, 60 Å) o gel de sílice EcoChrom (12–26, 60 Å). Se emplearon disolventes destilados de calidad técnica. Los rendimientos indicados se refieren a compuestos purificados cromatográficamente y espectroscópicamente puros, a menos que se indique lo contrario.

Los espectros de RMN 1H, 13C{1H}, DEPTq, COSY, HSQC y HMBC se obtuvieron en los espectrómetros Bruker DRX-500, AV-600 y AV-700. Todos los espectros de 1H NMR se referenciaron con respecto a SiMe4 mediante una resonancia del disolvente deuterado empleado o la impureza del disolvente; cloroformo (7,26 ppm), DMSO (3,33 ppm) y metanol (3,31 ppm) para 1H RMN; cloroformo (77,00 ppm), DMSO (39,52 ppm) y metanol (49,00 ppm) para RMN de 13C. Todos los espectros de RMN se obtuvieron a temperatura ambiente (aproximadamente 22 °C), a menos que se especifique lo contrario. Los datos se informan como (s = singlete, d = doblete, t = triplete, m = multiplete o sin resolver, br = señal amplia, constante(s) de acoplamiento en Hz, integración). Los espectros de 13C-NMR se registraron con desacoplamiento completo de 1H. Las mediciones de servicio fueron realizadas por el equipo de servicio de RMN de la Instalación de Resonancia Magnética Nuclear de la Universidad McMaster por el Dr. Bob Berno y la Dra. Hilary A. Jenkins.

Los análisis espectrométricos de masas se realizaron como mediciones ESI de alta resolución en un Waters/Micromass QTof Global Ultima (espectrómetro de masas de tiempo de vuelo cuadrupolo) o EI de alta resolución en un instrumento Waters/Micromass GCT (espectrómetro de masas de tiempo de vuelo). por el servicio de espectrometría de masas del Centro Regional McMaster de Espectrometría de Masas (MRCMS) de la Universidad McMaster por Megan Fair y Leah Allan bajo la supervisión del Dr. Kirk Green.

Las relaciones enantioméricas se determinaron utilizando una inyección manual de HPLC Agilent 1220 Infinity con un detector de longitud de onda variable, utilizando una columna Daicel Chiralpak® AD-H (150 × 4,6 mm, 5 µ), n-hexano/iPrOH (80:20) como fase móvil. ; caudal 0,75 ml/min, temperatura de la columna 25 °C, λ236 nm, muestra 1 mg/1 ml disuelta en la fase móvil.

Las rotaciones ópticas se midieron en un polarímetro Perkin-Elmer 241 MC, [α] se da en grados cm3g-1 dm-1 yc se da en g cm-3.

Las líneas humanas iPSC (hiPSC) subclonan alias R139361416_SD y CR00427420_SA; Biológicos infinitos RUCDR; Piscataway, Nueva Jersey, Estados Unidos) fueron empleados en este estudio. Las líneas iPSC R139361416_SD y CR00427420_SA se denominaron 01SD y 9001, respectivamente, en este estudio.

Las células iPSC humanas (hiPSC) se obtuvieron del Repositorio de ADN y células de la Universidad de Rutger (Piscataway, Nueva Jersey, EE. UU.). En el estudio actual no se utilizaron participantes/datos/muestras humanos. Todas las muestras provienen de un repositorio público (RUCDR) y no están identificadas. Las HiPSC se cultivaron en medio mTeSR1-plus suplementado con inhibidores duales de SMAD SB431542 (10 µM) y LDN193189 (100 nM) (NPS/Dual-SMAD) para inducir la formación de neuroectodermo. Después de 8 a 10 días, las rosetas neurales se aislaron manualmente, se transfirieron a placas recubiertas de Matrigel y se cultivaron en StemDiff Neural Progenitor Medium (STEMCELL Technologies) para la expansión de NPC.

Se emplearon las líneas 01SD y 9001 de iPSC humanas (hiPSC) para generar organoides similares al cerebro. Los organoides se generaron como se describió anteriormente (ref) con algunas modificaciones en la parte inicial con respecto a la generación de esferoides que contienen rosetas neurales. Las hiPSC cultivadas con medio mTeSR™ plus (STEMCELL Technologies) en placas de 6 pocillos recubiertas con Matrigel se separaron con Accutase y luego se disociaron en una suspensión de células individuales pipeteando suavemente. Se sembraron en placas de 96 pocillos con fondo en U de baja unión a una densidad de 9000 células/pocillo, en medio mTeSR plus suplementado con inhibidor de la proteína quinasa asociada a Rho (inhibidor de ROCK) Y27632 (STEMCELL™) para generar cuerpos embrioides (EB). . Después de tres días, para inducir neuroectodermo, el medio se cambió a medio Essential 6 (ThermoFisher Scientific) suplementado con inhibidores duales de SMAD SB431542 10 µM (MilliporeSigma S4317-5MG) y LDN193189 100 nM (MilliporeSigma SML055-9-25MG. Los cultivos se observaron en diariamente.

El día 8, los EB en diferenciación se enjuagaron con medio Eagle modificado de Dulbecco: mezcla de nutrientes F-12 (DMEM/F12, Gibco 11330-032) y se cultivaron en medio neuronal (DMEM/F12 suplementado con suplemento de aminoácidos no esenciales 1X MEM (MEM-NEAA). , CORNING® 25–025-CI), 1X Glutamax (Gibco 35050-061), 1 × suplemento de N2 (Gibco 17502-048) y 1 µg/mL de heparina (STEMCELL™ 07980)) en placas de Petri de 10 cm sin tratar. Estas placas se colocaron en un agitador orbital en la incubadora a 70 rpm (Orbi-Blotter™). El medio de cultivo se redujo a la mitad cada tres días.

El día 20, el medio de cultivo se reemplazó con medio de diferenciación de organoides corticales I ((CODMI: DMEM:F12/Neurobasal (1:1 v/v) suplementado con 1X Glutamax, 1X B-27 (VitA[-]), 0,5X Aminoácidos no esenciales, 0,5X N-2, insulina (2,5 μg) y 1X penicilina-estreptomicina (P/S). El día 25, el medio CODM-I se reemplazó con medio de diferenciación de organoides corticales II (CODM-II: DMEM /F12-Neurobasal (1:1 v/v) suplementado con 1X glutamax, 1X B-27 (VitA[+]), 0,5X aminoácidos no esenciales, 0,5X N-2, insulina (2,5 μg), BDNF ( 10 ng/ml) y 1X P/S. El medio de cultivo se cambió cada 3 días. El día 42, el medio CODM-II se reemplazó con medio neuronal BrainPhys™ (StemCell Technologies).

Se infectaron cultivos en monocapa de NPC a una MOI de 0,1 con un virus recombinante HSV-1 que expresa los genes indicadores EGFP y RFP bajo el control de los promotores HSV-1 ICP0 y gC, respectivamente (Ref). Dos horas después de la infección, se retiraron los inóculos, las células se lavaron y cultivaron en medio StemDiff Neural progenitor suplementado con los análogos de alcaloides descritos anteriormente a una concentración de 10 µM o ACV a 50 µM. Las células se analizaron mediante citometría de flujo el día 3 pi.

Se infectaron organoides cerebrales de catorce semanas de edad de forma singular en placas de 96 pocillos de fijación baja con fondo en U con una construcción HSV-1 DualF (6000 ufp/organoide). Después de 2 h, se retiraron los inóculos, los organoides se lavaron y se cultivaron en medio BrainPhys suplementado con los compuestos probados (10 μM) o ACV (50 μM). Los organoides que se infectaron en presencia de ACV se trataron previamente con el antiviral durante 24 h.

La viabilidad de los organoides se analizó mediante el ensayo de calceína AM (BioLegend; catálogo n.° 425201), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, los organoides se expusieron individualmente en un tubo Eppendorf que contenía Calceína-AM 0,01 μM y se incubaron a 37 °C. Después de 20 minutos, los organoides se transfirieron a medio de cultivo precalentado y se incubaron durante 10 minutos más. Después de la incubación, las señales de fluorescencia se registraron utilizando un microscopio fluorescente LED LEICA DMIL a través de un objetivo de aire 0,16 NA 4×.

La fluorescencia celular total corregida (CTCF) se obtuvo midiendo la fluorescencia de EGFP en 799 organoides tratados y no tratados, y normalizando el área completa del organoide utilizando la ecuación CTCF = densidad integrada - (área completa del organoide × fluorescencia media de las lecturas de fondo).

Los NPC se cultivaron en medio progenitor neuronal StemDiff, que contenía los compuestos 2b, 8 (10 µM) o vehículo. Todos los ensayos se realizaron por triplicado. Las células se recogieron después de 72 h y el ARN celular se extrajo (RNeasy Mini Kits, Qiagen) y se cuantificó utilizando Agilent 4200 TapeStation (Agilent Technologies). Las bibliotecas de ARN total se generaron utilizando la Guía de preparación de muestras de ARN total monocatenario TruSeq de Illumina, Revisión E. El primer paso implicó la eliminación de ARN ribosómico y mitocondrial utilizando oligos biotinilados específicos de la diana combinados con perlas de eliminación de ARNr Ribo-Zero. Después de la purificación, el ARN restante se fragmentó utilizando cationes divalentes a temperatura elevada, que luego se copiaron en el ADNc de la primera cadena utilizando transcriptasa inversa y cebadores aleatorios, seguido de la síntesis de ADNc de la segunda cadena utilizando la ADN polimerasa I y la ARNasa H. Posteriormente, se extrajo una única base de adenosina. añadido a cada uno de los fragmentos de ADNc, seguido de la ligación de un adaptador. Los productos se purificaron y enriquecieron con PCR para crear la biblioteca de ADNc final. Las bibliotecas de ADNc se validaron utilizando el kit de premezcla de cebadores KAPA Biosystems con cebadores de ADN compatibles con Illumina y un fluorímetro Qubit 2.0. La calidad se examinó utilizando un Agilent Bioanalyzer Tapestation 2200. Las bibliotecas de ADNc se combinaron a una concentración final de 1,8 pM. La generación de grupos y la secuenciación de doble índice de lectura pareada de 100 pb se realizaron en Illumina NextSeq 500 (Hospital Infantil de Pittsburgh, Universidad de Pittsburgh).

La calidad de lectura de la secuenciación se evaluó utilizando el software fastQC v0.11.4 y CLCbio v11.0.1. El número promedio de lecturas por muestra fue de 39,5 millones (DE = 4,8 millones de lecturas). Las secuencias se recortaron en función del puntaje de calidad utilizando el algoritmo de recorte de Mott modificado implementado en el software biológico CLC, utilizando una probabilidad de error de corte de recorte de 0,05. Las bases ambiguas se recortaron utilizando un límite de base ambigua máximo posterior al recorte de 2. Las lecturas recortadas luego se asignaron al genoma humano GRCh38/hg38, utilizando la secuencia y la anotación proporcionadas por Ensembl (versión 82). Aproximadamente el 92 % de las lecturas se mapearon en pares (SD = 1,14) en todas las muestras, y el 97,7 % de las lecturas se mapearon en total (SD = 0,45). Los datos se depositaron en la base de datos Gene Expression Omnibus del NCBI (GSE201156).

Se utilizó PCR de transcripción inversa cuantitativa (qRT-PCR) para determinar el análisis de expresión génica mediante ensayos Taqman (Thermo Fisher, EE. UU.) específicos para los genes TP53 (ID Hs01034249_m1), SIRT1 (Hs01009006_m1) y BCL2 (Hs00608023_m1) y ATF4 con el conjunto de cebadores: FWD. 5′TCAAACCTCATGGGTTCTCC3′ y REV: 5′GTGTCATCCAACGTGGTCAG3′. Cada muestra tuvo 3 o 4 réplicas biológicas. La reacción de transcripción inversa se obtuvo a partir de 100 ng de ARN total utilizando hexámeros aleatorios y SuperScript IV (Thermo Fisher). Las condiciones para la reacción de RT fueron cebado a 65 °C durante 5 min, seguido de 55 °C durante 10 min y 80 °C durante 10 min; Luego se mantuvo a 4 °C. Se agregaron 2 µl de ADNc diluido (1:3) a Luna Universal Probe qPCR Master Mix o Luna Universal qPCR Master Mix (NBE, EE. UU.) hasta el volumen total de 10 µL. La PCR se realizó en CFX96 (BioRad, EE. UU.) en las siguientes condiciones: 95 °C durante 60 s, seguido de 40 ciclos de 95 °C durante 15 s y 30 °C durante 1 min. Los niveles de expresión génica se determinaron mediante Ct (ciclo de umbral). El ∆Ct se calculó restando el Ct de GAPDH (FWD: 5′ACCCACTCCTCCACCTTTG3′, REV: 5′CTCTTGTGCTCTTGCTGG3′) del Ct del gen de interés. El ∆∆C se calculó restando el ∆C de la muestra de referencia del ∆C de las muestras de control. El cambio en veces se presentó mediante la siguiente ecuación 2 − ΔΔ Ct.

Se infectaron ratones suizos ND4, de 4 a 6 semanas de edad (Envigo labs) por vía ocular. Se anestesiaron los ratones con isoflurano y se escarificó ligeramente la córnea con un calibre de 23 ga. aguja. Se aplicaron 1 x 105 ufp (en 5 µl) de HSV-1 cepa 17syn+ a la superficie corneal. Al mismo tiempo, un grupo de ratones (n = 10) se trató con 2 µL de una solución 50 µM del compuesto 8 en DMSO y el otro grupo (n = 10) se trató con 2 µL de DMSO (vehículo), aplicado a los ojos. Los ojos se trataron con vehículo o con el compuesto 8 cada día durante 4 días. Para evaluar el efecto del compuesto 8 en el curso de la infección, se limpiaron los ojos diariamente con un hisopo de Dacron y el virus eluyó en medio MEM. Se evaluó la presencia de virus infeccioso en el eluato del hisopo mediante un ensayo de placa estándar en monocapas de células de piel de conejo.

Todos los análisis estadísticos se realizaron en GraphPad Prism 9. El análisis de varianza unidireccional (ANOVA) seguido de un análisis post hoc para el análisis que se muestra en las Figs. 1, 3 y 5 (ver figuras para más detalles).

Los conjuntos de datos utilizados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente previa solicitud razonable.

Dittmar, M. y col. Las pruebas de reutilización de fármacos revelan vías de entrada específicas de cada tipo de célula y fármacos aprobados por la FDA activos contra el SARS-Cov-2. Rep. celular 35, 108959 (2021).

Artículo CAS Google Scholar

Cragg, GM, Grothaus, PG y Newman, DJ Impacto de los productos naturales en el desarrollo de nuevos agentes anticancerígenos. Química. Rev. 109, 3012–3043 (2009).

Artículo CAS Google Scholar

Sayed, AM et al. La naturaleza como tesoro escondido de posibles fármacos anti-SARS-CoV: una justificación estructural/mecanicista. RSC Avanzado. 10, 19790–19802 (2020).

Artículo ADS CAS Google Scholar

Cully, M. Una historia de dos objetivos antivirales y los medicamentos COVID-19 que los unen. Nat. Rev. Disco de drogas. 21, 1–5 (2022).

Artículo de Google Scholar

Jin, Z. & Yao, G. Amaryllidaceae y alcaloides de sceletium. Nat. Pinchar. Reps. 36, 1462-1488 (2019).

Artículo CAS Google Scholar

Evidente, A. et al. Evaluación biológica de alcaloides de amaryllidaceae estructuralmente diversos y sus derivados sintéticos: descubrimiento de nuevas pistas para el diseño de fármacos contra el cáncer. Planta Med. 75, 501–507 (2009).

Artículo CAS Google Scholar

Pettit, GR, Gaddamidi, V., Cragg, GM, Herald, DL y Sagawa, Y. Aislamiento y estructura de pancratistatina. J. química. Soc. Química. Comunitario. 1693–1694 (1984).

Pettit, GR, Gaddamidi, V. & Cragg, agente antineoplásico GM, 105. Zephyranthes grandiflora. J. Nat. Pinchar. 47, 1018-1020 (1984).

Artículo CAS Google Scholar

Pettit, GR y cols. Agente antineoplásico, 120. Pancratium littorale. J. Nat. Pinchar. 49, 995–1002 (1986).

Artículo CAS Google Scholar

Pettit, GR, Pettit, GR III., Backhaus, RA, Boyd, MR & Meerow, AW Agentes antineoplásicos, 256. Isocarbostirilos inhibidores del crecimiento celular de himenocallis. J. Nat. Pinchar. 56, 1682-1687 (1993).

Artículo CAS Google Scholar

McLachlan, A., Kekre, N., McNulty, J. & Pandey, S. Pancratistatin: un compuesto anticancerígeno natural que se dirige específicamente a las mitocondrias de las células cancerosas para inducir la apoptosis. Apoptosis 10, 619–630 (2005).

Artículo CAS Google Scholar

Kekre, N., Griffin, C., McNulty, J. y Pandey, S. Pancratistatin induce apoptosis en muestras de leucemia clínica con un efecto mínimo sobre las células mononucleares de sangre periférica no cancerosas. Quimioterapia contra el cáncer. Farmacéutico. 10, 619–630 (2005).

Google Académico

Pandey, S., Kekre, N., Naderi, J. y McNulty, J. Inducción de muerte celular apoptótica específicamente en células cancerosas humanas y de rata mediante pancratistatina. Artif. Sangre de células. Sub. Biotecnología. 33, 279–295 (2005).

Artículo CAS Google Scholar

Siedlakowski, P. y col. Sinergia de PST y tamoxifeno en células de cáncer de mama para inducir la apoptosis dirigiéndose a las mitocondrias. Biol del cáncer. El r. 7, 376–384 (2008).

Artículo CAS Google Scholar

Ingrassia, L. et al. Análisis de la relación estructura-actividad de nuevos derivados de narciclasina (un derivado de isocarbostirilo de Amaryllidaceae) como posibles agentes anticancerígenos. J. Med. Química. 52, 1100-1114 (2009).

Artículo CAS Google Scholar

Lefranc, F. et al. La narciclasina, un modulador del crecimiento de las plantas, activa Rho y las fibras de estrés en las células de glioblastoma. Mol. Cáncer Ther. 8, 1739-1750 (2009).

Artículo CAS Google Scholar

Gabrielsen, B. y col. Actividad antiviral (ARN) de constituyentes de isoquinolina seleccionados de Amaryllidaceae y síntesis de sustancias relacionadas. J. Nat. Pinchar. 55, 1569-1581 (1992).

Artículo CAS Google Scholar

Renard-Nozaki, J., Kim, T., Imakura, Y., Kihara, M. y Kobayashi, S. Efecto de los alcaloides aislados de Amaryllidaceae sobre el virus del herpes simple. Res. Virol. 140, 115-128 (1989).

Artículo CAS Google Scholar

D'Aiuto, L. et al. Comparación de tres plataformas de detección de fármacos basadas en células para la infección por HSV-1. Res. antivirus. 142, 136-140 (2017).

Artículo de Google Scholar

D'Aiuto, L. et al. R430: Un potente inhibidor de los virus de ADN y ARN. Ciencia. Rep. 8, 16662 (2018).

ADS del artículo Google Scholar

Li, S.-Y. et al. Identificación de compuestos naturales con actividades antivirales contra el coronavirus asociado al SARS. Res. antivirus. 67, 18-23 (2005).

Artículo CAS Google Scholar

Tan, S., Banwell, MG, Ye, W.-C., Lan, P. & White, LV La inhibición de los virus de ARN por los alcaloides de Amaryllidaceae: oportunidades para el desarrollo de fármacos anticoronavirus de amplio espectro. Chem Asian J. 17, e202101215 (2022).

CAS Google Académico

McNulty, J. & Zepeda-Velazquez, C. Secuencia de Michael-aldol organocatalítica enantioselectiva del producto natural anticancerígeno (+)-trans-dihidrolicoricidina. Angélica. Química. En t. Ed. 53, 8450–8454 (2014).

Artículo CAS Google Scholar

Revu, O. y col. Síntesis total del producto natural (+)-trans-dihidronarciclasina mediante una adición organocatalítica asimétrica [3+3]-cicloadición y descubrimiento de su potente actividad contra el virus del Zika (ZIKV). Química. Seleccionar. 1, 5895–5899 (2016).

CAS Google Académico

McNulty, J. y col. El ensayo neuronal iPSC identifica farmacóforos de amaryllidaceae con múltiples efectos contra las infecciones por herpesvirus. ACS Med. Química. Letón. 7, 46–50 (2016).

Artículo CAS Google Scholar

Brown, CE y cols. La entrada asimétrica a los análogos 10b-aza de los alcaloides de Amaryllidaceae revela un efecto electrónico pronunciado sobre la actividad antiviral. ACS Omega 3, 11469 (2018).

Artículo CAS Google Scholar

Nieto-Garcia, O. & Alonso, R. Síntesis y citotoxicidad de análogos de (+/−) -7,9-didesoxi-pancratistatina. Org. Biomol. Química. 11, 515–522 (2013).

Artículo CAS Google Scholar

Banwell, MG y cols. Anhídrido trifluorometanosulfónico–4-(N,N-dimetilamino)piridina como combinación de reactivos para efectuar la ciclación de Bischler-Napieraiski en condiciones suaves: aplicación a la síntesis total de los alcaloides de Amaryllidaceae N-metilcrinasiadina, anhidrolicorinona, hippadina y oxoassoanina. Química. Comunitario. 2551–2553 (1995).

Kreipl, AT, Reid, C. & Steglich, W. Síntesis total de los alcaloides del pirrol marino policitona A y B. Org. Letón. 4, 3287–3288 (2002).

Artículo CAS Google Scholar

Wang, K. y col. Diversos mutantes de timidina quinasa del virus del herpes simple tipo 1 en neuronas y ganglios humanos individuales. J. Virol. 81, 6817–6826 (2007).

Artículo CAS Google Scholar

Honess, RW & Watson, DH Resistencia y sensibilidad del virus del herpes simple al ácido fosfonoacético. J. Virol. 21, 584–600 (1977).

Artículo CAS Google Scholar

Zheng, W. y col. Patrones de infección por el virus del herpes simple 1 en células progenitoras neurales. J. Virol. 94, e00994-e1020 (2020).

Artículo de Google Scholar

Kapałczyńska, M. et al. Cultivos de células 2D y 3D: una comparación de diferentes tipos de cultivos de células cancerosas. Arco. Medicina. Ciencia. 14, 910–919 (2018).

Google Académico

Costa-Mattiolo, M. & Walter, P. La respuesta integrada al estrés: del mecanismo a la enfermedad. Ciencia 368, eat5314 (2020).

Artículo de Google Scholar

Pakos-Zebrucka, K. et al. La respuesta integrada al estrés. Representante EMBO. 17, 1374-1395 (2016).

Artículo CAS Google Scholar

Humeau, J. y col. Fosforilación del factor de iniciación eucariota-2α (eIF2α) en autofagia. Enfermedad por muerte celular. 11, 433 (2020).

Artículo CAS Google Scholar

Ahmad, L., Mostowy, S. y Sancho-Shimizu, V. Interacción autofagia-virus: de la biología celular a las enfermedades humanas. Frente. Desarrollo celular. Biol. 6, 00155 (2018).

Artículo de Google Scholar

Koyuncu, E. et al. Las sirtuinas son factores de restricción virales conservados evolutivamente. MBio 5, e02249-14 (2014).

Artículo de Google Scholar

Rivas, C., Aaronson, SA y Munoz-Fontela, C. Doble función de p53 en la inmunidad antiviral innata. Virus 2, 298–313 (2010).

Artículo CAS Google Scholar

Ho, M.-M. et al. La acumulación de ácidos biliares intracelulares inducida por virus activa el eje TGR5-β-arrestina-SRC para permitir la inmunidad antiviral innata. Resolución celular. 29, 193-205 (2019).

Artículo de Google Scholar

Trasino, SE et al. ¿Un papel de los retinoides en el tratamiento de la COVID-19?. Clínico. Exp. Farmacéutico. Fisiol. 47, 1765-1767 (2020).

CAS Google Académico

Szeto, MD y cols. Interferón y respuesta del receptor tipo peaje 7 en COVID-19. Implicaciones del imiquimod tópico para la profilaxis y el tratamiento. Dermatología 237, 847 (2021).

Artículo CAS Google Scholar

Papapanou, M. y col. Plitidepsina: Mecanismos y perfil clínico de un agente antiviral prometedor contra COVID-19. J. Pers. Medicina. 11, 668 (2021).

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Agradecemos al NSERC por una subvención de investigación de descubrimiento (JMcN), al Instituto de Investigación Médica Stanley 13R-002 (JMcN) y al Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares (NINDS) 1R01NS115082-01A1 y 1R21NS096405-01A1 (LDA) por su apoyo financiero. PRK reconoce el apoyo de EY08098, Research to Prevent Blindness Inc, NY y la fundación Eye & Ear de Pittsburgh.

Departamento de Química y Biología Química, Universidad McMaster, Hamilton, ON, L8S 4M1, Canadá

James McNulty, Chanti Babu-Dokuburra, Jon Scattolon & Carlos Zepeda-Velazquez

Departamento de Psiquiatría, Instituto y Clínica Psiquiátrica Occidental, Facultad de Medicina de la Universidad de Pittsburgh, Pittsburgh, PA, 15213, EE. UU.

Maribeth A. Wesesky, Jill K. Caldwell, Wenxiao Zheng, Vishwajit L. Nimgaonkar y Leonardo D'Aiuto

Departamento de Oftalmología, Facultad de Medicina de la Universidad de Pittsburgh, Pittsburgh, PA, EE. UU.

Pablo R. Kinchington

Departamento de Microbiología Molecular y Genética, Universidad de Pittsburgh, Pittsburgh, PA, EE. UU.

Pablo R. Kinchington

Departamento de Genética Molecular y Microbiología, Facultad de Medicina, Universidad de Florida, Gainesville, FL, 32610, EE. UU.

David C. Bloom

Segundo Hospital Xiangya, Facultad de Medicina de Xiangya, Universidad Central Sur, Changsha, China

Wenxiao Zheng

Departamento de Ingeniería Biomédica, Universidad Carnegie Mellon, Pittsburgh, PA, EE. UU.

Jadranka Milosevic

Capture Diagnostics Inc, Pittsburgh, PA, EE. UU.

Jadranka Milosevic

Administración de Veteranos Sistema de Salud de Pittsburgh, 4100 Allequippa St (University Drive C), Pittsburgh, PA, 15240, EE. UU.

Vishwajit L. Nimgaonkar

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J.McN.: Autor correspondiente: El Dr. McNulty concibió y diseñó la química orgánica sintética, interpretó datos, escribió manuscritos y obtuvo fondos utilizados para el estudio. LD: Autor correspondiente: El Dr. D'Aiuto concibió los estudios antivirales, desarrolló protocolos utilizando iPSC, análisis de secuenciación de ARN e interpretación de datos, y escribió el manuscrito. CBD, JS y CZV realizaron la síntesis y caracterización de todos los derivados de alcaloides. MAW, JKC, WZ, PRK y JM realizaron estudios antivirales y ayudaron con el análisis y la interpretación de datos. VLN concibió experimentos antivirales, obtuvo fondos utilizados para el estudio y escribió un manuscrito. DCB realizó estudios antivirales in vivo, ayudó con la interpretación de datos y escribió el manuscrito. Agradecemos al Sr. Joel Wood por el análisis de datos de RNASeq.

Correspondencia a James McNulty o Leonardo D'Aiuto.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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McNulty, J., Babu-Dokuburra, C., Scattolon, J. et al. El alcaloide de amaryllidaceae del anillo A truncado modula la respuesta al estrés integrada de la célula huésped y exhibe actividad antiviral contra HSV-1 y SARSCoV-2. Informe científico 13, 1639 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-28691-0

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Recibido: 11 de agosto de 2022

Aceptado: 23 de enero de 2023

Publicado: 30 de enero de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-28691-0

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