Peroxidasas NADH y NADPH como mecanismos de defensa antioxidante en el sulfato intestinal

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 13922 (2023) Citar este artículo

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Las heces de animales y humanos suelen incluir bacterias reductoras de sulfato intestinal (BSR). El sulfuro de hidrógeno y el acetato son los productos finales de su reducción disimilatoria del sulfato y pueden crear un efecto sinérgico. Aquí, informamos las actividades de peroxidasa NADH y NADPH de SRB intestinal Desulfomicrobium orale y Desulfovibrio piger. Buscamos comparar actividades enzimáticas bajo la influencia de varios regímenes de temperatura y pH, así como realizar análisis cinéticos de velocidades de reacción enzimática, cantidades máximas del producto de reacción, tiempos de reacción, velocidades máximas de las reacciones enzimáticas y constantes de Michaelis en Extractos libres de células de SRB intestinal, D. piger Vib-7 y D. orale Rod-9, recolectados de fases de crecimiento exponencial y estacionario. Se determinó la temperatura óptima (35 °C) y el pH (7,0) para la actividad de ambas enzimas. La diferencia en las tendencias de las constantes de Michaelis (Km) durante las fases exponencial y estacionaria es notable entre D. piger Vib-7 y D. orale Rod-9; D. orale Rod-9 mostró Km mucho mayor (la excepción es la NADH peroxidasa de D. piger Vib-7: 1,42 ± 0,11 mM) durante las dos fases monitoreadas. Los estudios de las peroxidasas NADH y NADPH, como supuestos sistemas de defensa antioxidante de la BRS intestinal y datos detallados sobre las propiedades cinéticas de esta enzima, expresadas por la descomposición del peróxido de hidrógeno, podrían ser importantes para aclarar los mecanismos evolutivos de los sistemas de defensa antioxidante, su etiología. papel en el proceso de reducción disimilatoria de sulfatos, y su posible papel en el desarrollo de enfermedades intestinales.

Las bacterias reductoras de sulfato (BSR) se desarrollan rápidamente en presencia de lactato y sulfato en el intestino humano, lo que conduce a la acumulación de sulfuro de hidrógeno (H2S), que es tóxico y dañino para las células epiteliales intestinales1,2,3,4,5 ,6,7,8. Sin embargo, el H2S es una fuente de azufre para las arqueas metanogénicas que también se detectan en gran abundancia en el tracto gastrointestinal. Además, es posible que la sobreproducción y acumulación de H2S sea dañina y no su mera presencia9, 10. Las enfermedades inflamatorias intestinales (EII) pueden desarrollarse en humanos y animales debido a un aumento en el número de SRB y en la intensidad de las disimilaciones. reducción de sulfato en el intestino2, 11,12,13,14,15,16.

El sulfato inorgánico u otras formas oxidadas de azufre se convierten en sulfuro mediante SRB disimilatorio17,18,19. Dado que estas comunidades bacterianas son heterótrofas, necesitan un suministro de carbono orgánico. Los compuestos orgánicos simples como el lactato, piruvato y malato pueden servir como fuente de carbono para las especies Desulfovibrio y Desulfomicrobium18, 20; posteriormente se oxidan a acetato con la reducción simultánea de sulfato a sulfuro1, 21, 22. A través de este proceso de oxidación de múltiples etapas para moléculas orgánicas, los heterótrofos obtienen su energía celular23,24,25,26. Las especies de SRB suelen emplear lactato como sustrato, que luego oxidan a acetato utilizando piruvato, simultáneamente24.

Las enzimas antioxidantes endógenas pueden actuar eliminando especies reactivas de oxígeno (ROS). Las enzimas antioxidantes bien conocidas que previenen la producción intracelular de ROS y la peroxidación lipídica incluyen la superóxido dismutasa (SOD), la catalasa y las peroxidasas27. Mientras que la catalasa descompone el peróxido de hidrógeno (H2O2) mediante su dismutación en agua y oxígeno molecular (O2), la SOD transforma los radicales superóxido en peróxido de hidrógeno (H2O2)28.

Las peroxidasas (EC 1.11.1.7) son enzimas que contienen hemo que utilizan H2O2 para catalizar la oxidación de una variedad de sustratos29.

Un subproducto de ROS no radicales del metabolismo aeróbico típico es el H2O2. Sin embargo, los altos niveles de H2O2 podrían transformarse en otras ROS más reactivas, como los radicales hidroxilo, que pueden oxidar biomoléculas y causar envejecimiento, muerte celular, daño tisular, trastornos cardiovasculares y transformación maligna. Por lo tanto, un componente crucial de toda actividad antioxidante en un sistema biológico es la actividad eliminadora de H2O230. En el H2O2 y otros aceptores de hidrógeno es donde la peroxidasa es más activa en comparación con otros aceptores de electrones. El ascorbato, varios aminoácidos y sustancias polifenólicas son donantes de hidrógeno para SRB31:

La NADH peroxidasa (EC 1.11.1.1) es responsable de la catálisis enzimática de la siguiente reacción química32,33,34,35:

La función de la NADH peroxidasa es inactivar el H2O2 que se genera dentro de la célula, por la glicerol-3-fosfato oxidasa durante el metabolismo del glicerol y la dismutación del superóxido, antes de que el H2O2 pueda causar daño a los componentes celulares esenciales. NADH elimina H2O2 potencialmente tóxico en condiciones de crecimiento aeróbico y este proceso representa una defensa enzimática contra el estrés oxidativo mediado por H2O2. La enzima también puede proteger contra el H2O2 exógeno y de esa manera contribuir a la virulencia bacteriana32,33,34,36. Una NADPH peroxidasa (EC 1.11.1.2) es una enzima que cataliza H2O2 mediante la misma reacción química que la NADH peroxidasa, pero en lugar de NAD+ se forma NADP+37.

Las peroxidasas NADH y NADPH se han descrito en bacterias Desulfovibrio reductoras de sulfato que carecen de actividad catalasa (excepto D. desulfuricans ATCC 27774)38. Las peroxidasas activas NADH y NADPH catalizan la escisión de H2O2 en las células de D. desulfuricans. Estas enzimas se encontraron tanto en las fracciones que contienen membranas del periplasma como del citoplasma. La NADPH peroxidasa se localiza principalmente en el periplasma (70%), mientras que la NADH peroxidasa se distribuye casi por igual en el periplasma y en las fracciones que contienen membrana del citoplasma (60 y 40%, respectivamente)38. La actividad de la peroxidasa no depende del estado fisiológico del cultivo. Por otro lado, la actividad NADH peroxidasa de las células en la fase de crecimiento estacionario es mayor que la actividad enzimática en las células durante la fase de crecimiento exponencial38. Cabe destacar que las peroxidasas de BRS intestinales de D. piger y D. orale nunca han sido bien caracterizadas. Existen algunos datos sobre peroxidasas en diferentes organismos así como en BRS aislados del medio ambiente en la literatura actualmente disponible27,28,30,38. Sin embargo, aún no se ha informado sobre la actividad y la cinética de esta enzima de la BRS intestinal de D. piger y D. orale.

Los objetivos del presente estudio fueron determinar la actividad de la peroxidasa en extractos libres de células de las bacterias intestinales reductoras de sulfato D. piger Vib-7 y D. orale Rod-9 como una importante enzima del sistema antioxidante y realizar evaluaciones cinéticas de sus actividades enzimáticas. .

Las bacterias reductoras de sulfato Desulfovibrio piger Vib-7 (GenBank: KT881309.1) y Desulfomicrobium orale Rod-9 (GenBank: MF939896), que se aislaron de las heces del intestino grueso de un ser humano sano y se identificaron mediante el análisis de secuencia del ARNr 16S. gen, fueron el foco de este estudio20, 39.

En un medio anóxico C líquido de Postgate modificado, se cultivaron ambas bacterias20, 39,40,41. Para crear un medio libre de O2, el medio se hirvió en agua durante 30 minutos antes de enfriarlo a 30 °C. Se empleó Na2S (1%) en NaHCO3 al 1% como reductor antes de la siembra de bacterias en el medio (E0 del medio era – 200 mV). El potencial se midió con un medidor de pH: Greisinger G1500. Se usó una solución estéril de NaOH 10 N para reducir el pH final del medio a 7,5. La proporción del volumen de inoculación con respecto al volumen medio fue del 5%. Las bacterias se cultivaron anaeróbicamente en matraces durante 72 h a 37 °C41. Además, se incluyeron FeS y Na2S reducidos en el medio, lo que proporcionó las condiciones redox necesarias para los cultivos SRB. La biomasa de los cultivos bacterianos se determinó fotométricamente, según el método descrito anteriormente en el artículo publicado39: se transfirió aproximadamente 1 ml de medio líquido sin sal de Mohr a una cubeta de plástico y se llevó a un biofotómetro (Eppendorf BioPhotometerD30) para su tara. Posteriormente se transfirió 1 mL de suspensión bacteriana a otra cubeta y se llevó nuevamente al biofotómetro. Antes de utilizar SRB para los experimentos, siempre se medía la densidad óptica (OD340). La densidad óptica del inoculado se midió y normalizó para que fuera la misma cantidad de células que inoculaban todo el crecimiento bacteriano.

Después de 18 h de crecimiento exponencial y 36 h de crecimiento estacionario, las células se recogieron, se centrifugaron durante 30 minutos a 5000 xg a 4 °C, se lavaron con tampón Tris-HCl 0,02 M y luego se suspendieron en el mismo tampón en una proporción de 2–2,5 g de peso húmedo por 10 ml de la misma solución. Las células bacterianas se rompieron y homogeneizaron utilizando el desintegrador ultrasónico a 22 kHz durante 1 min a 0 °C con posterior centrifugación (17.000 xg, 60 min, 4 °C) para eliminar los restos celulares y obtener extractos libres de células.

La tasa de peroxidación de NADH o NADPH se midió a 340 nm (ɛ = 6220 M-1 cm-1). La adición de 2 mM de H2O2 inició el proceso. La mezcla de ensayo contenía extractos libres de células diluidos en tampón Tris-HCl (50 mM, pH 7,6) (volumen final, 1 ml). Como se mencionó anteriormente38, se agregaron NADH y NADPH en cantidades que oscilaron entre 50 y 500 μM. Las muestras de control eran la misma mezcla, pero sin extractos libres de células bacterianas. Se utilizó el método de Bradford para calcular el contenido de proteínas en los extractos libres de células42.

Cuando reaccionan el H2O2 y la sonda se produce un producto proporcional a la cantidad de actividad peroxidasa, y esta reacción se puede observar mediante técnicas colorimétricas (570 nm) y fluorométricas (λex = 535/λem = 587 nm) (kit Sigma-Aldrich para el Se utilizó la determinación de la actividad peroxidasa). La cantidad de peroxidasa que reduce 1,0 mol de H2O2 por minuto a 37 °C se conoce como una unidad (U = 1 μmol/min). Como proteína U × mg-1, se expresó la actividad enzimática específica.

La actividad de enzimas específicas en extractos libres de células de ambas cepas bacterianas también se determinó bajo la influencia de dos factores importantes: valores de pH (4,0–10,0) y rangos de temperatura (20, 25, 30, 35, 40 y 45 °C). Bajo los distintos ajustes (pH y temperatura), la composición de la misma combinación permaneció esencialmente igual. El pH se ajustó con adición de ácido (HCl) y base (NaOH). También se ajustó la temperatura de la mezcla y se cultivó bajo diferentes regímenes de temperatura.

En un medio de incubación estándar (discutido anteriormente) con propiedades físicas y químicas ajustadas de los parámetros de prueba relevantes (es decir, la duración de la incubación, la concentración del sustrato, la temperatura y el pH), se llevó a cabo el estudio cinético de la reacción enzimática. La velocidad de reacción inicial (instantánea) (V0), la velocidad de reacción máxima (Vmax), la cantidad máxima del producto de reacción (Pmax) y el tiempo de reacción característico (tiempo de media saturación, τ) se identificaron como los parámetros cinéticos que describen la Reacción de H2O2.

Se utilizaron cálculos estequiométricos para determinar el volumen del producto de reacción. Se utilizó un diagrama de Lineweaver-Burk43 para establecer los parámetros cinéticos que definen los procesos de peroxidasa, incluida la constante de Michaelis (Km) y la velocidad máxima de reacción de la degradación del sustrato. Se obtuvieron velocidades iniciales con diversas concentraciones de sustrato en condiciones normales de ensayo para analizar el mecanismo cinético del sustrato de las peroxidasas.

Para modelar los datos cinéticos para ecuaciones de velocidad de equilibrio rápido, los datos obtenidos también se examinaron mediante ajuste de curva global en SigmaPlot (Systat Software, Inc., https://systatsoftware.com/products/sigmaplot/sigmaplot-how-to-cite- sigmaplot/, Palo Alto, CA 94303, EE. UU.) que describe V secuencial ordenado = (Vmax [A] [B])/(KA KB + KB [A] + [A] [B]) y V secuencial aleatorio = ( Vmax [A] [B])/(α KA KB + KB [A] + KA [B] + [A] [B]) mecanismos cinéticos, donde V es la velocidad inicial, Vmax es la velocidad máxima, KA y KB son los valores de Km para los sustratos A y B, respectivamente, y α es el factor de interacción si la unión de un sustrato cambia la constante de disociación del otro44.

Se utilizaron los software MS Office y Origin (www.originlab.com) para calcular las propiedades cinéticas y estadísticas de los datos. Se utilizó la prueba t de Student para analizar los resultados de la investigación utilizando métodos de estadística de variación. Para determinar la ecuación lineal se utilizó el método de mínimos cuadrados. El valor absoluto del coeficiente de correlación r osciló entre 0,90 y 0,98. La importancia de los parámetros calculados de la línea se comprobó mediante la prueba F de Fisher. La aproximación se consideró precisa cuando P ≤ 0,0545. Las diferencias generales entre las actividades enzimáticas y los parámetros cinéticos de las peroxidasas NADH y NADPH se determinaron mediante análisis de componentes principales (PCA). Se estimó que el valor propio de dos grupos estaba por encima de cero, lo que explica el 99 % de la varianza total.

Los autores confirman que todos los métodos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices y regulaciones pertinentes. Los autores confirman que todos los protocolos experimentales fueron aprobados por el comité de la Universidad de Masaryk (n.º EKV-2021-060). Los autores confirman que se obtuvo el consentimiento informado de todos los sujetos y/o de sus tutores legales.

El SRB intestinal D. piger Vib-7 alcanzó la fase de crecimiento después de 36 h en la fase estacionaria, pero D. orale Rod-9 tuvo el máximo después de 60 h. La recolección de muestras se realizó de ambos cultivos después de 24 h (fase exponencial) y 60 h (fase estacionaria) del cultivo (Fig. 1A). La actividad peroxidasa específica, que es una enzima importante en el proceso de defensa antioxidante en SRB, se midió en el extracto libre de células de D. piger Vib-7 y D. orale Rod-9, tomado durante la fase exponencial y estacionaria (Fig. .1B). La mayor actividad de NADH peroxidasa (79,25 y 48,55 U × mg-1 de proteína) se detectó entre los extractos de D. piger Vib-7 y D. orale Rod-9, cultivados durante las fases estacionarias. Aunque la actividad de D. orale Rod-9 fue ligeramente diferente entre las fases exponencial y estacionaria, la actividad de las peroxidasas NADPH en D. piger Vib-7 fue similar (p > 0,05) en las fases exponencial y estacionaria.

Acumulación de biomasa de D. piger Vib-7 y D. orale Rod-9 (A), así como de actividad peroxidasa NADH/NADPH (B) en extracto libre de células de BRS intestinal dependiendo de su fase fisiológica (media ± DE, n = 5).

La actividad enzimática está fuertemente influenciada por factores ambientales y físicos, incluidos la temperatura y el pH. En algunos casos, la temperatura y el pH pueden simular la actividad y al mismo tiempo a veces también disimular la actividad. Las actividades de las peroxidasas NADH y NADPH en los géneros SRB intestinales Desulfovibrio y Desulfomicrobium nunca han sido monitoreadas con precisión científica; Se estudiaron los efectos de la temperatura y el pH de la mezcla de reacción sobre la actividad de la peroxidasa en los extractos libres de células de SRB (Fig. 2).

El efecto de la temperatura (A) y el pH (B) sobre la actividad peroxidasa de NADH y NADPH (media ± DE, n = 5) en los extractos libres de células preparados a partir de varias fases de crecimiento bacteriano (exponencial y estacionaria).

La temperatura óptima para las reacciones enzimáticas se determinó en ambas especies bacterianas de los géneros Desulfovibrio y Desulfomicrobium y para ambas enzimas (NADH y NADPH peroxidasas) a 35 °C. El aumento (máximo 45 °C) o disminución (mínimo 20 °C) de la temperatura óptima resultó en una disminución extrema de la actividad enzimática en los extractos recolectados durante las fases de crecimiento exponencial y estacionario. Sin embargo, ambas enzimas mostraron una menor actividad a temperaturas más bajas (20–25 °C), durante la fase estacionaria de ambos cultivos bacterianos probados, en comparación con los resultados obtenidos a la temperatura óptima (Fig. 2A). La actividad enzimática más alta de las peroxidasas NADH y NADPH para D. piger Vib-7 y D. orale Rod-9 se midió a un pH de 6,5 a 7,0. para ambas enzimas durante las fases estacionaria y exponencial. El aumento del pH resultó en otra reducción extrema de la actividad enzimática, donde la actividad enzimática más baja fue a pH 8, mientras que la actividad enzimática de D. orale estuvo por debajo del límite de detección en la fase de crecimiento exponencial. Se observó una tendencia similar en condiciones de pH inferiores a 5, donde la actividad enzimática no fue detectable durante la fase exponencial en ambas cepas bacterianas (Fig. 2B). Obviamente, la actividad enzimática fue inhibida por un pH inferior a 5, pero en la fase estacionaria, la actividad de la NADH peroxidasa aún era detectable en concentraciones muy bajas (en ambos extractos bacterianos).

Así, en función de la temperatura y el pH, la actividad enzimática a menudo presentaba curvas en forma de campana. Estas enzimas funcionaron mejor a 35 °C y un pH de 6,5 a 7,0, respectivamente. La actividad enzimática en los extractos bacterianos libres de células de SRB se redujo en respuesta a los cambios de temperatura y pH.

La investigación de las características cinéticas de ambos tipos de peroxidasas implicó el estudio de la dinámica de la reacción de acumulación del producto (Fig. 3). Según la evidencia experimental, las curvas cinéticas de la actividad de la peroxidasa tienden a saturarse (Fig. 3A). Según el análisis de los datos, la cinética de la actividad de la peroxidasa en las bacterias reductoras de sulfato fue consistente con una reacción de orden cero entre 0 y 1 min (el gráfico que muestra la relación entre la formación del producto y el tiempo de incubación fue casi lineal durante todo este tiempo). intervalo).

Parámetros cinéticos de la actividad peroxidasa NADH y NADPH en los extractos libres de células de D. piger Vib-7 y D. orale Rod-9 preparados a partir de varias fases de crecimiento bacteriano (exponencial y estacionario): dinámica de acumulación del producto y su linealización de curvas en {P/t; P} coordenadas (media ± DE, n = 5; R2 > 0,93; F < 0,02) (A); el efecto de diferentes concentraciones de sustrato (H2O2) sobre la actividad enzimática y la linealización de las curvas de concentración en el gráfico de Lineweaver-Burk, donde V es la velocidad de la reacción enzimática y [H2O2] es la concentración del sustrato (n = 5; R2 > 0,92; F < 0,005) (B).

Por tanto, el tiempo de incubación para los extractos de células bacterianas fue de 2,5 min. En todo el rango de tiempo durante la fase de desarrollo exponencial, los extractos libres de células de D. piger Vib-7 produjeron más productos de peroxidasa NADH y NADPH que D. orale Rod-9 (38 ± 3,52 y 27 ± 2,33 µmol × mg-1 de proteína). (Tabla 1). En comparación con las peroxidasas NADPH de los dos extractos, la actividad peroxidasa NADH fue mayor durante los primeros 1,5 minutos en la fase estacionaria tanto de D. piger Vib-7 como de D. orale Rod-9 (Fig. 3A).

Linealizando los datos en P/t; En las coordenadas P se calcularon las características cinéticas fundamentales de la reacción en las bacterias reductoras de sulfato. La concentración de sustrato afecta el comportamiento cinético de las actividades peroxidasa NADH y NADPH (H2O2). La actividad de la enzima examinada aumentó monótonamente a medida que las concentraciones de H2O2 aumentaron de 0,5 a 5 mM, y permaneció en el mismo nivel (meseta) en concentraciones de sustrato superiores a 2,0 mM (Fig. 3B).

La enzima estaba saturada con el sustrato y dosis mayores de H2O2 (2,0 a 5,0 mM) no tuvieron efecto sobre su actividad; permaneció constante (meseta). La pendiente tangente y la posición en la que la dependencia 1/V; Para identificarlas se utilizaron curvas 1/[S] que intersecan el eje vertical. Al linealizar los datos en el gráfico de Lineweaver-Burk, se determinaron los parámetros cinéticos fundamentales de la actividad peroxidasa de NADH y NADPH en D. piger Vib-7 y D. orale Rod-9. Ambas cepas tenían parámetros cinéticos de peroxidasa NADH y NADPH considerablemente diferentes: D. orale Rod-9 y D. piger Vib-7. La cantidad máxima de la reacción de producción (Pmax) se usó para calcular la velocidad de reacción inicial (instantánea) de las enzimas (V0).

Como se muestra en la Tabla 1, el V0 para la reacción de peroxidasa NADPH fue mayor en ambas cepas durante la fase de crecimiento exponencial en comparación con NADH: D. piger Vib-7 (289 ± 27,43 µmol × min-1 × mg-1 de proteína) y D. oral Rod-9 (144 ± 13,55 µmol × min-1 × mg-1 de proteína). Por el contrario, el parámetro V0 para la reacción de NADH peroxidasa fue más del doble y triplicado mayor que el NADPH durante la fase estacionaria para las dos cepas incluidas, D. piger Vib-7 y D. orale Rod-9, respectivamente. La misma observación se observó con la reacción del producto (Pmax), tanto durante el crecimiento exponencial como estacionario; D. piger Vib-7 tuvo una mayor reacción de peroxidasa NADH y NADPH en comparación con D. orale Rod-9. Los valores del tiempo de reacción (τ) durante la fase de crecimiento exponencial fue mayor (reacción de peroxidasa NADH, 0,36 ± 0,29 min) para D. piger Vib-7, pero el NADPH fue mayor para D. orale Rod-9 (0,19 ± 0,017 min). ). D. orale Rod-9 tuvo valores más altos del tiempo de reacción (τ) para ambas reacciones de peroxidasa (NADH y NADPH) durante la fase estacionaria en comparación con otra cepa probada (D. piger Vib-7). Los valores de Vmax presentaron la misma tendencia, ya que los valores de NADH fueron mayores en la cepa D. piger Vib-7, pero los de NADPH para la cepa D. orale Rod-9; Sin embargo, las diferencias durante la fase estacionaria son casi insignificantes.

La constante de Michaelis (Km) fue menor durante la fase exponencial para la cepa Vib-7 de D. piger, tanto para NADH como para NADPH. Km fue mayor (reacción NADH peroxidasa, 1,42 ± 0,11 mM) durante la fase estacionaria para D. piger Vib-7. Valores bajos de Km indican una alta afinidad de la enzima por el sustrato en cuestión. Se puede tener en cuenta que el seguimiento de Km es necesario para diferenciar el mecanismo inhibidor (tipo competitivo o no competitivo). Los resultados descritos de las reacciones NADH y NADPH y las propiedades cinéticas de la enzima en extractos libres de células de las cepas D. piger Vib-7 y D. orale Rod-9 son novedosos y nunca antes se habían informado en la literatura.

El análisis de componentes principales (PCA) de todos los parámetros calculados ha dado lugar a 5 grupos según el valor propio. El primer grupo: Dm NADH Sta, DvNADPH EXP, Dv NADPH Sta y Dm NADPH Sta; el segundo grupo: Dv NADH EXP y Dm NADH EXP; el tercer grupo: Dv NADH Sta; el cuarto grupo: Dm NADPH Sta; el quinto grupo: Dm NADPH EXP. Las fases de crecimiento exponencial se separan principalmente de las fases de crecimiento estacionario (solo DvNADPH EXP estaba en el grupo con las fases de crecimiento estacionario) (Fig. 4).

Análisis de componentes principales (PCA) basado en parámetros cinéticos de la actividad peroxidasa NADH y NADPH en los extractos libres de células de D. piger Vib-7 (Dv) y D. orale Rod-9 (Dm) preparados a partir de diversas fases de crecimiento bacteriano (exponencial). (EXP) y estacionario (Sta)).

Las enzimas antioxidantes son sistemas endógenos que pueden eliminar ROS30. La SOD, la catalasa y las peroxidasas pertenecen a enzimas antioxidantes capaces de prevenir la formación de ROS intracelulares, al igual que la peroxidación lipídica46. Mientras que la catalasa descompone los radicales superóxido en agua y O2, la superóxido dismutasa es capaz de convertir los radicales superóxido en H2O228.

Las enzimas que contienen hemo llamadas peroxidasas (EC 1.11.1.7; peróxido de hidrógeno oxidorreductasa) pueden catalizar la oxidación de sustratos utilizando H2O247, un producto ROS no radical del metabolismo aeróbico regular. La gran cantidad de H2O2 podría convertirse en ROS más reactivos (p. ej., radicales hidroxilo capaces de oxidar biomoléculas) que pueden dañar los tejidos, causar muerte celular o carcinogénesis, envejecimiento y tener efecto sobre las enfermedades cardiovasculares. Por lo tanto, un componente crucial de la actividad antioxidante general es la actividad eliminadora de H2O248, 49.

El descubrimiento de nuevas especies de SRB resultó en cambios significativos en su taxonomía, al igual que en los conceptos sobre el metabolismo de las SRB. Hoy en día, muchos SRB se consideran anaerobios aerotolerantes y el O2 podría desempeñar un papel fisiológico importante en el metabolismo de los SRB. Se sugiere que la SRB utilice O2 como aceptor final de electrones durante la síntesis de ATP50, 51. También cabe señalar que el O2 inhibe algunas de las enzimas críticas de la SRB, como la lactato deshidrogenasa y la alcohol deshidrogenasa dependiente de NAD52.

Algunas especies de SRB son parcialmente aerotolerantes hasta cierto punto53,54,55,56, e incluso después de una exposición prolongada al O2, algunas especies de SRB pueden reanudar el crecimiento anóxico. Estos BRS aerotolerantes contienen principalmente SOD y catalasa55, 57, 58. No se ha obtenido mucha información de experimentos previos sobre las enzimas implicadas en el consumo de O2 por parte de los BRS. La cadena de reducción de O2 consiste en una NADH oxidasa (NADH rubredoxina oxidorreductasa), que está presente en D. gigas59, 60. También se han encontrado actividades de NADH oxidasa en D. desulfuricans NCIB 830157 y D. vulgaris Hildenborough60. Hardy y Hamilton55 encontraron actividades reductoras de O2 en varios D. vulgaris, aunque no se detectó actividad NADH oxidasa. Según el trabajo anterior, se observó que la reducción de O2 en las especies SRB tiene lugar en el periplasma y está ligada al citocromo c3, como propuso Postgate61 para la cepa D. desulfuricans. Probablemente al menos tres sistemas independientes sean capaces de reducir el O2 en el CSN de D. desulfuricans. De esos tres sistemas, un sistema está activo sólo a bajas concentraciones de O2, pero se inhibe con altas concentraciones de O2; los dos sistemas restantes están activos en todas las concentraciones de O238.

La sugerencia de que el primer sistema probablemente esté activo en el periplasma y esté vinculado al citocromo c3. Las actividades de oxidación de NADH y NADPH se encuentran en extractos celulares solubles en todas las concentraciones de O2 y estas actividades disminuyeron con una disminución de la concentración de O2. La actividad NADH oxidasa estuvo presente en todas las cepas examinadas y todas respondieron de manera similar a los cambios en las concentraciones de O232, 61.

Estos resultados sugieren que las SRB contienen NADH oxidasa que es capaz de reducir el O2 directamente a H2O, aunque algunas cepas de SRB pueden reducir el O2 a H2O2; El H2O2 se reduce aún más a H2O, ya que estas cepas poseen la NADH peroxidasa. Las cepas de D. desulfuricans examinadas contenían NADH y NADPH oxidasas y peroxidasas38, por lo tanto, estos hallazgos corresponden con nuestra investigación que incluyó D. piger Vib-7 y D. orale Rod-9, donde también se observó la actividad de estas enzimas.

En la investigación de van Niel et al., estas cepas no acumulan poliglucosa durante el crecimiento con diversos sustratos. Estas propiedades los distinguen de las siguientes cepas: D. salexigens y D. gigas. En todos los casos, la adición de sustratos resultó en una rápida disminución de la actividad de la NADH oxidasa. Se observó la misma observación con la NADPH oxidasa, la NADH peroxidasa y la NADPH peroxidasa, al igual que con el consumo de O2 por parte de las células completas de las cepas de D. desulfuricans. Es posible que se formen intermediarios reactivos, que dañan la enzima, durante las reacciones de oxidación con O2. Cuanto mayor sea el daño y, por tanto, la inactivación, cuanto más rápida sea la oxidación38.

Las cepas de la bacteria anaeróbica facultativa Lactobacillus casei IGM394 portan varios genes que permiten a la cepa tolerar el O2 y las especies reactivas de oxígeno (ROS), aunque aún no se han revelado las funciones completas. Se observó una disminución del crecimiento y una alta acumulación de H2O2 en la NADH peroxidasa en comparación con los tipos salvajes. Debido a la capacidad de degradación de H2O2, se reveló que la NADH peroxidasa es una importante enzima degradante de H2O2 en L. casei IGM394. Por el contrario, el mecanismo de tolerancia al H2O2 depende únicamente de la NADH peroxidasa en L. casei IGM39462.

La inactivación en este organismo se considera una propiedad intrínseca de las enzimas y sus sustratos. La inactivación sólo ocurre en el caso de que estén presentes tanto sustratos oxidables como O2. Según los resultados, el complejo enzima-sustrato es propenso a la desnaturalización. Las NADH oxidasas de Enterococcus faecalis son una de las mejor estudiadas. Las NADH oxidasas de D. gigas60 y E. faecalis63 contienen FAD, no contienen iones metálicos centrales y son sensibles a los agentes sulfhidrilo. La eliminación gradual de FAD es la razón de la inestabilidad de la NADH oxidasa de S. faecalis64. Aunque la adición de FAD a los extractos celulares aumentó la tasa de oxidación del NADH, no tuvo ningún efecto sobre la tasa de inactivación. Los experimentos se realizaron también en la cepa mutante en la que se observó actividad de peroxidasa NADH, pero no en la cepa salvaje. También se demostraron actividades de NADH peroxidasa en sistemas in vitro que contienen peróxido de hidrógeno de NADH y una NADH oxidorreductasa bacteriana de Desulfovibrio vulgaris y Clostridium perfringens65.

Las especies desulfovibrio (grupo SRB) son microorganismos anaeróbicos ubicuos y tienen una gran diversidad metabólica4, 18, 22, 66,67,68. Todos los miembros de la SRB están unificados porque utilizan sulfato como aceptor terminal de electrones, reduciéndolo a H2S. Aunque las especies de SRB están clasificadas como anaerobias estrictas, son capaces de lidiar con la presencia temporal de O2 (en hábitats naturales, como aguas superficiales marinas, tapetes microbianos, alcantarillas, arrozales y oleoductos), y se encontraron varias especies de Desulfovibrio. para poder oxidar sustratos orgánicos bajo niveles bajos de O269. De lo contrario, los Desulfovibrio que son aerotolerantes no pueden utilizar el O2 para su crecimiento50, por lo tanto, en presencia de sulfuro, los SRB son más sensibles al O253.

Para obtener más información sobre las peroxidasas en SRB, examinamos los genomas de organismos estrechamente relacionados. Sin embargo, a pesar de nuestros esfuerzos por obtener información más concreta, los hallazgos son los siguientes. Solo un genoma refseq para Desulfomicrobium orale (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NZ_CP014230.1) está disponible en el NCBI. Se descubrió que los genes de Desulfomicrobium orale codifican una supuesta peroxidasa de tipo Dyp (WP_066605144.1), una supuesta tiol-peroxidasa (WP_066607718.1), una supuesta superóxido dismutasa (WP_066603707.1) y dos supuestas peroxireducinas (WP_066605219.1; WP_066606413.1). Sin embargo, lo que es más relevante para nuestro estudio, varias oxidorreductasas están codificadas en el genoma, como dos supuestas oxidorreductasas dependientes de FAD (WP_066608725.1; WP_066606935.1; WP_066605517.1), dos oxidorreductasas dependientes de NAD(P)/FAD (WP_066604797.1; WP_151192312.1) y dos oxidorreductasas dependientes de NAD(P) (WP_066606986.1; WP_066607102.1). Desde nuestra perspectiva, podría ser razonable considerar que las últimas cinco enzimas podrían desempeñar un papel en las actividades enzimáticas específicas que se investigan. Sin embargo, los rasgos enzimáticos predichos por el proceso automatizado de anotación del genoma no necesariamente sugieren una participación directa de estas enzimas en las funciones de la peroxidasa. Identificar las características de las enzimas implicaría la clonación, expresión y caracterización de cada una de las supuestas enzimas. Alternativamente, otro enfoque podría implicar la identificación de las supuestas peroxidasas pertinentes a través de la transcriptómica dentro de experimentos de crecimiento específicos. Sería interesante seguir ambas rutas en futuros estudios. Aún así, nuestro estudio no se refiere principalmente a las propiedades genéticas de las enzimas examinadas mediante un enfoque bioinformático. También hay un genoma de un cerdo Desulfovibrio estrechamente relacionado disponible en el NCBI. Este genoma no es un genoma refseq. Si bien hicimos un esfuerzo por localizar la información, no exploramos los resultados del proceso de anotación automatizada para este genoma. Además, realizamos una búsqueda bibliográfica adicional para determinar si se habían informado previamente actividades de peroxidasa para otros SRB. Lamentablemente no se encontraron registros relacionados con este aspecto. Por lo tanto, hasta ahora tampoco se ha probado la actividad de las peroxidasas NADH y NADPH. Existe una escasez generalizada de información sobre las peroxidasas en los SRB ambientales. En cuanto a los SRB ambientales, la presencia de peroxidasas podría depender de la cepa o especie específica que se esté investigando. Algunos SRB pueden poseer peroxidasas como parte de sus vías metabólicas, mientras que otros pueden depender de enzimas o mecanismos alternativos para controlar el estrés oxidativo.

Las peroxidasas NADH y NADPH son enzimas importantes que supuestamente están involucradas en los sistemas de defensa antioxidante de la SRB intestinal. Ambas peroxidasas podrían representar una respuesta evolutiva al estrés oxidativo y pueden mantener su actividad en un amplio rango de condiciones de temperatura y pH, apoyar el proceso de reducción disimilatoria de sulfato y la producción de H2S. A 35 °C y pH 7,0, se encontraron las actividades enzimáticas específicas máximas.

En el caso de D. piger Vib-7 en comparación con D. orale Rod-9, los parámetros cinéticos de la actividad específica de la enzima, incluidos V0 y Vmax, fueron significativamente mayores. Las concentraciones del sustrato (H2O2) afectaron los parámetros cinéticos de las reacciones enzimáticas. Entre D. piger Vib-7 y D. orale Rod-9, los valores de Km fueron notablemente diferentes a lo largo de las fases de crecimiento exponencial y estacionario. La NADH peroxidasa de D. piger Vib-7 es la excepción a este hallazgo. D. orale Rod-9 mostró kilómetros mucho más altos durante ambas fases.

Como las peroxidasas Vib-7 de D. piger y Rod-9 de D. orale podrían estar involucradas en sus respectivos metabolismos, así como en la reducción disimilatoria de sulfato y la producción de H2S, los resultados obtenidos pueden considerarse como conocimientos y perspectivas importantes para aclarar la cuestión. el papel etiológico en el desarrollo de enfermedades intestinales en humanos y animales.

Los conjuntos de datos utilizados y/o analizados durante el presente estudio están disponibles del autor correspondiente previa solicitud razonable.

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Este estudio fue apoyado por la Agencia de Subvenciones de la Universidad Masaryk (MUNI/A/1280/2022). Financiación de acceso abierto de la Universidad de Viena.

Departamento de Biología Experimental, Facultad de Ciencias, Universidad Masaryk, Kamenice 753/5, 62500, Brno, República Checa

Ivan Kushkevych y Monika Vítězová

Departamento de Ciencias de los Alimentos de Origen Vegetal, Facultad de Higiene y Ecología Veterinaria, Universidad de Ciencias Veterinarias de Brno, Palackého tř. 1946/1, 612 42, Brno, República Checa

Dani Dordevic

Departamento de Tecnología de Laboratorios Médicos, Facultad de Salud y Técnicas Médicas, Universidad Politécnica de Duhok, Duhok, Región del Kurdistán, Irak

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Departamento de Biología Oral e Investigación Dental Experimental, Facultad de Odontología, Universidad de Szeged, Tisza Lajos Krt. 64-66., 6720, Szeged, Hungría

Mario Gajdács

Facultad de Medicina, Instituto de Microbiología Médica, Universidad Semmelweis, Nagyvárad Tér 4, 1089, Budapest, Hungría

Eszter Ostorházi

Grupo de Fisiología y Biotecnología Archaea, Departamento de Ecología Funcional y Evolutiva, Universität Wien, 1090, Viena, Austria

Simon K.-MR Rittmann

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Todos los autores de este artículo contribuyeron: IK, DD, MA, MG, EO, MV y SK-MRR analizaron e interpretaron datos de Illumina; IK, DD, MA, MG conceptualización, metodología e investigación de este estudio; Investigación y curación de datos de IK, DD y MV, redacción de borradores originales, redacción de manuscritos y edición de IK, DD, MA, MG, EO, MV y SK-MRR. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Ivan Kushkevych o Simon K.-MR Rittmann.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Kushkevych, I., Dordević, D., Alberfkani, MI et al. Peroxidasas NADH y NADPH como mecanismos de defensa antioxidante en bacterias reductoras de sulfato intestinal. Informe científico 13, 13922 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-41185-3

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Recibido: 08 de marzo de 2023

Aceptado: 23 de agosto de 2023

Publicado: 25 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-41185-3

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