Nuevos agentes quimioterapéuticos proapoptóticos basados ​​en la quinolona.

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 11346 (2023) Citar este artículo

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En el estudio actual, diseñamos y sintetizamos una serie de nuevos derivados de quinolina 10a-p como agentes antiproliferativos dirigidos al cáncer mediante la inhibición de VEGFR-2. El acoplamiento molecular preliminar para evaluar las interacciones de los derivados diseñados con el sitio de unión de VEGFR-2 (código PDB: 4ASD) mostró posturas de unión e interacciones comparables a las de sorafenib. Los compuestos sintetizados exhibieron actividad inhibidora de VEGFR-2 con una CI50 que oscilaba entre 36 nM y 2,23 µM en comparación con sorafenib (CI50 = 45 nM), donde el derivado 10i fue el más potente. Además, los derivados sintetizados se evaluaron in vitro para determinar su actividad citotóxica contra la línea celular cancerosa HepG2. Siete compuestos 10a, 10c, 10d, 10e, 10i, 10n y 10o (IC50 = 4,60, 4,14, 1,07, 0,88, 1,60, 2,88 y 2,76 μM respectivamente) mostraron una mejor actividad antiproliferativa que sorafenib (IC50 = 8,38 μM). El compuesto 10i se probó frente a la línea celular normal Transformada Epitelial-2 de Hígado Humano (THLE-2) para evaluar su citotoxicidad selectiva. Además, se analizó 10i, como potente representante de la serie, para determinar su actividad apoptótica y la influencia de la cinética del ciclo celular en HepG2, sus efectos sobre la expresión genética de VEGFR-2 y la expresión proteica de los marcadores apoptóticos Caspasa-7 y Bax. . El compuesto 10i demostró tener un papel potencial en la apoptosis al causar un aumento significativo en los cuartiles apoptóticos tempranos y tardíos, una actividad notable en la elevación de la expresión proteica relativa de Bax y Caspasa-7 y una reducción significativa de la expresión del gen VEGFR-2. En conjunto, los resultados obtenidos indican que el compuesto 10i tiene un potencial prometedor como compuesto líder para el desarrollo de nuevos agentes anticancerígenos.

El cáncer se considera la segunda causa de muerte a nivel mundial1. La búsqueda de nuevos medicamentos contra el cáncer sigue siendo una demanda en todo el mundo. Se están utilizando varios agentes anticancerígenos a pesar de sus efectos secundarios y su resistencia emergente. La necesidad de desarrollar nuevos agentes para una mayor eficacia con menos efectos adversos se puede explorar centrándose en las quinasas, ya que se sobreexpresan de forma variable en varios tipos de cáncer. Una de esas quinasas importantes es el receptor 2 del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR-2) debido a su importante papel en la angiogénesis, el proceso de formación de nuevos vasos sanguíneos utilizados para el suministro de oxígeno y nutrientes a las células, lo cual es un paso vital necesario. para el crecimiento del cáncer y la metástasis2. Este proceso se observa ampliamente en la mayoría de los tumores sólidos debido a su consumo significativamente mayor de glucosa, oxígeno y otros nutrientes debido a su rápido crecimiento en comparación con los tejidos normales3. Se informa que la inhibición de la angiogénesis tumoral potencia el efecto de otras opciones terapéuticas como la quimioterapia y la radioterapia, lo que sugiere que los agentes que actúan sobre el VEGF o sus receptores pueden coadministrarse con la terapia convencional para lograr la máxima eficacia4. Aunque existen varios inhibidores de la quinasa VEGFR-2 de molécula pequeña aprobados por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) para uso clínico, existen varias preocupaciones que limitan su uso, como la resistencia a los medicamentos y los efectos secundarios (cardiovasculares, hiperparatiroidismo y lesión renal). 5,6. Por lo tanto, todavía existe una gran demanda para descubrir nuevos inhibidores con resultados satisfactorios.

El sistema de anillos de quinolina ha sido identificado durante mucho tiempo como un núcleo versátil en el diseño de agentes biológicamente activos, ya que muchos derivados de quinolina exhiben diferentes actividades farmacológicas como antibacteriano7, antifúngico8, antipsicótico9, antipalúdico10, anestésico local11 y anticancerígeno12.

Además, se descubrió que el resto biaril urea se usa ampliamente como un fragmento estructural clave, especialmente en inhibidores de quinasa de tipo II para la unión a través de enlaces de hidrógeno y la interacción hidrófoba. También sirve como conector entre el resto de unión a la bisagra y la parte lipófila de la molécula que encajaría en la bolsa hidrófoba presente en la forma inactiva de las proteínas quinasas (la bolsa de salida de DFG). Se informó que el conector de urea interactúa con dos residuos conservados: un ácido glutámico presente en la hélice αC además del ácido aspártico en el motivo DFG. Por lo tanto, se sintetizaron y aprobaron sucesivamente varios compuestos que contienen bi-aril urea como inhibidores de VEGFR-2, como sorafenib, linifanib y tivozanib (Fig. 1)13,14. Estos fármacos se clasifican como inhibidores de tipo II porque se dirigen a la proteína en la conformación DFG-out, donde la estructura heteroaromática ocupa la bolsa de adenina e interactúa con la región bisagra, mientras que el resto biaril urea está orientado para encajar en una bolsa hidrófoba cerca. el sitio de unión de ATP y el residuo guardián, que se creó tras el desplazamiento del bucle DFG14. Se informa que el conector de urea de estos inhibidores está involucrado en interacciones clave de enlace H con los aminoácidos Glu885 y Asp104612,15.

Estructuras de fármacos inhibidores de VEGFR-2 aprobados por la FDA que presentan un resto biarilo.

Como continuación de nuestro trabajo para descubrir nuevos agentes anticancerígenos en general e inhibidores de VEGFR-2 en particular16,17,18,19,20,21, consideramos interesante explorar nuevos quimiotipos por su potencial anticancerígeno mediado por la inhibición de VEGFR-2. Así, basándose en el estudio de las relaciones estructura actividad (SAR) de varios inhibidores de VEGFR-2, además del análisis de las interacciones de unión de sorafenib y tivozanib como inhibidores de VEGFR-2, este proyecto describe el diseño y síntesis de una serie de nuevas quinolonas. -Derivados de 3-carboxamida 10a-p combinados con una cadena lateral de biaril urea para una mejor unión dentro del sitio activo. En nuestro diseño, para apuntar al sitio de unión de ATP, se usó el sistema de anillo de quinolona con diferentes sustituyentes en la posición 6, luego se usó una función 3-amida como conector para conectar el resto biaril urea. Tenga en cuenta que el núcleo de quinolona-3-carboxamida diseñado puede formar un pseudo anillo de seis miembros a través de un enlace de hidrógeno intramolecular entre el grupo carbonilo del núcleo de quinolona y la amida NH que puede orientar el resto biaril urea para una mejor interacción con el núcleo de quinolona-3-carboxamida diseñado. aminoácidos clave (Glu 885 y Asp 1046) y la bolsa hidrofóbica dentro del sitio activo VEGFR-2, lo que resulta en una alta afinidad. Finalmente, las manipulaciones moleculares adoptadas implicaron decorar el anillo de fenilo terminal con diferentes grupos de diversos caracteres electrónicos y lipófilos para mejorar la interacción con el bolsillo trasero hidrofóbico de VEGFR-2 y obtener una idea sobre el SAR de los compuestos diseñados (Fig. 2).

Estrategia de diseño de los inhibidores de VEGFR-2 basados ​​en quinolona-3-carboxamida objetivo 10a-p.

Los compuestos sintetizados se examinaron para determinar su actividad inhibidora de VEGFR-2 y su efecto citotóxico contra la línea celular HepG2 del carcinoma hepatocelular. Además, se evaluó la citotoxicidad selectiva en células hepáticas normales para el compuesto más potente. Además, se estudió la actividad proapoptótica, la alteración del ciclo celular y los cambios en la expresión de genes y proteínas afectados por el tratamiento de células HepG2 con el compuesto más activo, como potente representante de esta clase de compuestos. Finalmente, se realizaron estudios in silico que incluyeron modelos moleculares para los compuestos objetivo para dilucidar sus interacciones de unión dentro del sitio activo de VEGFR-2, así como predicciones de propiedades farmacocinéticas para el compuesto más activo.

Este trabajo de investigación implica la síntesis de una serie de nuevos derivados de 4-quinolona-3-carboxamida 10a-p. Las rutas sintéticas utilizadas para obtener los nuevos compuestos objetivo se representan en las Figs. 3, 4 y 5. La Figura 3 ilustra la síntesis de derivados de ácido 4-quinolona-3-carboxílico 6-sustituidos (4a y 4b) como materiales de partida. La síntesis del anillo de quinolona se logró mediante la reacción de Gould-Jacobs; donde en la primera etapa las anilinas sustituidas 1a,b se condensaron con etoximetilenomalonato de dietilo para proporcionar los derivados de 2-((fenilamino)metilen)malonato de dietilo 2a,b22,23,24. La ciclación de Gould-Jacobs de 2a,b en éter difenílico produjo los ésteres etílicos de 4-oxo-1,4-dihidroquinolina-3-carboxilato 3a,b22,23,24. Los derivados del ácido 4-oxo-1,4-dihidroquinolin-3-carboxílico 4a,b se prepararon mediante hidrólisis básica de sus análogos éster 3a,b a reflujo con NaOH 1 M seguido de acidificación con HCl diluido para liberar los derivados del ácido libre 4a. ,b25. Las estructuras de los compuestos 4a,b se confirmaron mediante espectroscopia de 1HNMR23,26.

Síntesis de derivados del ácido 4-quinolona-3-carboxílico 6-sustituidos 4a,b.

La Figura 4 resume la síntesis de los derivados de 1- (4-aminofenil) urea 9a – i como material de partida. Comenzando con la reacción del cloruro de 4-nitrobenzoilo 5 con azida de sodio para formar azida de 4-nitrobenzoilo 627. A esto le siguió el calentamiento de la azida 6 en tolueno seco para afectar el reordenamiento de Curtius y producir el correspondiente isocianato 7, que luego se hizo reaccionar con diferentes anilinas para producir los derivados de urea requeridos 8a-i. Los derivados de 1-(4-nitrofenil)-3-arilurea (8a-i) obtenidos se convirtieron en sus derivados amino reducidos 9a-i usando sulfuro de hidrógeno sódico en metanol acuoso. La solución que contenía sulfuro de hidrógeno de sodio se preparó recientemente agregando bicarbonato de sodio a una solución acuosa de sulfuro de sodio seguido de la adición de metanol28. Todos los derivados de 1-(4-aminofenil)-3-arilurea 9a-9i sintetizados se confirmaron mediante análisis de 1H-NMR donde se observaron todos los protones de acuerdo con el desplazamiento químico esperado con un nuevo pico característico que representa los dos protones intercambiables D2O del recién formado. -Grupo NH2 en el rango de 4,74 a 4,79 ppm.

Síntesis de derivados de 1-(4-aminofenil)-3-arilurea 9a-i.

La síntesis de los derivados objetivo 6-sustituidos-4-quinolona-3-carboxamida 10a-p se ilustra en la Fig. 5. En este trabajo, el paso final comprende la formación del enlace amida mediante el acoplamiento directo de la quinolinona-3-carboxílico obtenida. derivados de ácido 4a,b y los derivados de 1-(4-aminofenil)-3-arilurea 9a-i usando el agente de acoplamiento HATU y DIPEA como base para producir los compuestos 10a-p29,30,31,32. Las estructuras de los compuestos objetivo se confirmaron mediante análisis espectrales y elementales. Los espectros de 1HNMR de los compuestos 10a-p revelaron la desaparición de la señal intercambiable de D2O a 4,74–4,79 ppm de protones amino en 9a-i y la aparición de la señal intercambiable de D2O para el CONH recién formado a 12,19–12,47 ppm, asegurando así la formación de amida. vínculo. Además, las dos señales singlete asignadas para los grupos NH de urea se detectaron entre 7,88 y 9,04 ppm.

Síntesis de derivados de 4-quinolona-3-carboxamida 6-sustituidos (10a-p).

Todos los compuestos sintetizados 10a-p se evaluaron in vitro para determinar su actividad de inhibición de VEGFR-2 utilizando sorafenib como fármaco de referencia. El ensayo de quinasa se realizó utilizando el kit de ensayo de luminiscencia Kinase-Glo MAX de BPS Bioscience (número de catálogo: 40325). Los resultados se presentan como valores de IC50 (nM) ± SE y se enumeran en la Tabla 1. La mayoría de los compuestos probados mostraron una actividad inhibidora de VEGFR-2 de potente a moderada (36–578 nM), excepto los compuestos 10j, 10 h y 10k que mostraron baja actividad. actividad inhibidora (IC50 = 937–2226 nM). Vale la pena señalar que los compuestos 10i y 10o mostraron una actividad inhibidora de VEGFR-2 superior o comparable a la del fármaco de referencia sorafenib (IC50 = 36, 38 y 45 nM, respectivamente).

Un examen minucioso de los resultados ilustrados en la Tabla 1 reveló que la potencia inhibidora de los compuestos probados se ve afectada por el sustituyente en la posición 6 del anillo de quinolona, ​​así como por el sustituyente en el anillo de fenilo terminal.

En el presente estudio se evaluaron dos series principales; el primero representa los derivados de 6-cloroquinolonas (10a-i). El segundo muestra los derivados de 6-fluoroquinolonas (10j-p). En general, los derivados de 6-cloroquinolonas (10a-i) parecieron mostrar una mayor inhibición para VEGFR-2 que sus homólogos de 6-fluoroquinolonas (10j-p). Por ejemplo: el derivado de 6-cloroquinolona con fracción de fenil urea no sustituida 10a (R2 = H) mostró una IC50 = 138 nM en comparación con su análogo de 6-fluoroquinolona 10j con IC50 = 340 nM. De manera similar, el derivado de para-metilfenilo 10b (R2 = 4-CH3) de la serie de 6-cloroquinolonas tiene IC50 = 578 nM versus su contraparte de 6-flúor 10k con IC50 = 2226 nM. Por lo tanto, el análisis SAR implica que la incorporación de un átomo de cloro con un tamaño relativamente mayor y una lipofilia mayor que el flúor en la posición 6 del anillo de quinolona fue beneficiosa para la actividad inhibidora de VEGFR-2.

Con respecto al efecto de la naturaleza y la posición del sustituyente en el fenilo terminal sobre la actividad inhibidora de VEGFR-2, para la sustitución con un sustituyente lipófilo aceptor de electrones como el flúor en los compuestos 10e (R1 = Cl, R2 = 4-F, IC50 = 197 nM ) y 10n (R1 = F, R2 = 4-F, IC50 = 257 nM) dieron como resultado una actividad comparable a aquellos con fenilo no sustituido 10a (R1 = Cl, R2 = H, IC50 = 138 nM) y 10j (IC50 = 340 nM ). Por otro lado, el injerto de un grupo ciano atractor de electrones parahidrófilo en el compuesto 10g (R1 = Cl, R2 = 4-CN, IC50 = 1603 nM) fue perjudicial para el efecto inhibidor, esto podría atribuirse a un mal ajuste de este derivado en el bolsillo trasero hidrofóbico del sitio activo VEGFR-2. Asimismo, la sustitución con un pequeño resto lipófilo donador de electrones, como el grupo metilo en la posición para, como en los derivados 10b (R1 = Cl, R2 = 4-CH3, IC50 = 578 nM) y 10k (R1 = F, R2 = 4-CH3 , IC50 = 2226 nM) dio como resultado una actividad disminuida en comparación con los análogos de fenilo no sustituidos 10a y 10j. Curiosamente, la unión de un sustituyente isopropilo ramificado en 10i (R1 = Cl, R2 = 4-isopropilo, IC50 = 36 nM) y 10p (R1 = F, R2 = 4-isopropilo, IC50 = 97 nM) dio como resultado un aumento de más de 16 veces. en actividad en comparación con sus derivados parametil sustituidos 10b y 10k.

Pasar a la posición meta en el anillo de fenilo terminal; La adición de un grupo metilo en los compuestos 10c (R1 = Cl, R2 = 3-CH3, IC50 = 169 nM) y 10l (R1 = F, R2 = 3-CH3, IC50 = 317 nM) no tuvo ningún efecto significativo sobre la potencia cuando se relacionaron. a los derivados de fenilo no sustituidos 10a (R1 = Cl, R2 = H, IC50 = 138 nM) y 10j (R1 = F, R2 = H, IC50 = 340 nM), respectivamente. Sin embargo, las contrapartes meta-trifluorometilo más lipófilas aceptoras de electrones 10f (R1 = Cl, R2 = 3-CF3, IC50 = 104,5 nM) y 10o (R1 = F, R2 = 3-CF3, IC50 = 38 nM) mejoraron la actividad inhibidora. para producir el derivado 10o más potente entre los derivados de 6-fluoroquinolonas.

Notablemente, la fusión de un heterociclo adicional a las posiciones meta y para del fenilo terminal, el derivado de benzotiazol 10 h (R1 = Cl, R2 = 4,5-tiazolilo), dio como resultado una disminución de la actividad de aproximadamente 5,5 veces (IC50 = 937 Nuevo Méjico).

Finalmente, los cambios posicionales del sustituyente en el fenilo colgante afectaron la actividad biológica, esto se observó al comparar los valores de CI50 de los isómeros posicionales del metilo 10b-d y 10k-m. El orden de actividad fue derivados orto metilo sustituidos 10d (R1 = Cl, R2 = 2-CH3, IC50 = 69 nM) y 10m (R1 = F, R2 = 2-CH3, IC50 = 181 nM) > compuestos meta metilo sustituidos 10c (R1 = Cl, R2 = 3-CH3, IC50 = 169 nM) y 10l (R1 = F, R2 = 3-CH3, IC50 = 317 nM) > compuestos sustituidos con metilo 10b (R1 = Cl, R2 = 4-CH3 , IC50 = 578 nM) y 10k (R1 = F, R2 = 4-CH3, IC50 = 2226 nM). La mayor potencia de los derivados orto sustituidos 10d y 10m puede atribuirse a cambios volumétricos y, en consecuencia, conformacionales que afectan la coplanaridad en la molécula, lo que da como resultado confórmeros bioactivos más favorables33.

En conclusión, entre los derivados más activos de ambas series se encuentran los derivados meta trifluorometilo (10f y 10o) y los derivados paraisopropilo (10i y 10p). Esto muestra que la inserción de un grupo lipófilo donador o aceptor de electrones con un volumen considerable en la posición meta o para del resto de fenil urea dio como resultado una actividad inhibidora mejorada debido a un mejor llenado de la región hidrófoba del sitio activo de VEGFR-2. El SAR deducido se resume en la Fig. 6. Según estos hallazgos y en comparación con sorafenib (IC50 = 45 nM); Podemos sugerir que los compuestos 10i (IC50 = 36 nM) y 10o (IC50 = 38 nM) podrían servir como candidatos adecuados para una mayor investigación como inhibidores de VEGFR-2.

Resumen de los hallazgos de la relación estructura-actividad para la actividad inhibidora de VEGFR-2.

Los compuestos diana 10a-p también se probaron para determinar su actividad anticancerígena in vitro contra la línea celular tumoral HepG2 usando sorafenib como fármaco de referencia y los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 2. Este ensayo se realizó mediante 3-(4,5 Kit de ensayo toxicológico in vitro basado en bromuro de -dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT) de SIGMA (número de catálogo: M-5655). La sobreexpresión de VEGFR-2 se observa en diferentes tipos de cáncer como el carcinoma hepatocelular34. Por lo tanto, se seleccionó la línea celular HepG2 para la evaluación de la citotoxicidad de la CI50 de los compuestos probados 10a-p. Además, se considera que el cáncer de hígado es la sexta neoplasia maligna más frecuente y la cuarta causa más frecuente de muerte relacionada con el cáncer en todo el mundo35.

El examen de los resultados de la actividad citotóxica de los derivados sintetizados contra la línea celular tumoral HepG2 mostró actividad anticancerígena con valores de CI50 que oscilaban entre 0,88 y 62,02 µM. Siete compuestos 10a, 10c, 10d, 10e, 10i, 10n y 10o (IC50 = 4,60, 4,14, 1,07, 0,88, 1,60, 2,88 y 2,76 μM, respectivamente) mostraron una mejor actividad antiproliferativa que sorafenib (IC50 = 8,38 μM). Además, un derivado 10p (R1 = F, R2 = 4-isopropilo, IC50 = 8,14 μM) mostró una actividad comparable a la del sorafenib.

De acuerdo con el análisis SAR de la inhibición de VEGFR-2 de los derivados sintetizados, la mayoría de los derivados de 6-cloroquinolonas informaron una mejor actividad anticancerígena que sus correspondientes análogos de 6-fluoroquinolonas. Además, sustitución en el anillo de fenilo terminal con un grupo paraisopropilo como en los derivados 10i (R1 = Cl, R2 = 4-isopropilo, IC50 = 1,60 μM) y 10p (R1 = F, R2 = 4-isopropilo, IC50 = 8,14 μM ) mostró una potente actividad anticancerígena, así como sustitución de 2-metilo en los derivados 10d (R1 = Cl, R2 = 2-CH3, IC50 = 1,07 μM) y 10m (R1 = F, R2 = 2-CH3, IC50 = 13,01 μM) comparado con sorafenib.

Como excepción, los compuestos que llevan sustituyente para fluoró en el anillo de fenilo terminal 10e (R1 = Cl, R2 = 4-F, IC50 = 0,88 μM) y 10n (R1 = F, R2 = 4-F, IC50 = 2,88 μM) mostraron actividad citotóxica mejorada independientemente de su potencia inhibidora moderada de VEGFR-2.

En conclusión, la actividad citotóxica de la mayoría de los compuestos probados coincidió con el análisis SAR de sus actividades inhibidoras de VEGFR-2, lo que sugiere que la potente actividad anticancerígena de los compuestos sintetizados podría atribuirse a su actividad inhibidora de VEGFR-2.

Los compuestos 10i y 10o exhibieron la mejor actividad inhibidora de VEGFR-2 (IC50 = 36 y 38 nM, respectivamente) con una potente actividad citotóxica contra células tumorales HepG2 (IC50 = 1,60 y 2,76 μM, respectivamente); en consecuencia, se sometieron a un examen de citotoxicidad contra la línea celular normal Transformed Human Liver Epithelial-2 (THLE-2) utilizando Sorafenib como fármaco de referencia (Tabla 3). El índice de selectividad (SI) de los compuestos diseñados se calculó como una relación de CC50 frente a la línea celular normal (THLE-2) y CI50 en la línea celular cancerosa (HepG2), que refleja la selectividad de estos compuestos y, en consecuencia, su perfil de seguridad. Los compuestos 10i y 10o informaron índices de selectividad más altos (SI = 13,13 y 5,52, respectivamente) que el fármaco de referencia sorafenib (SI = 2,20), lo que indica un perfil de citotoxicidad aceptable. Dado que el compuesto 10i mostró una selectividad mayor que el 10 o, se seleccionó para estudios adicionales.

Una característica distintiva de las células cancerosas es la pérdida del control apoptótico, que permite a las células sobrevivir más tiempo y da más tiempo para la acumulación de mutaciones que pueden aumentar la invasividad durante la progresión del tumor, estimular la angiogénesis, desregular la proliferación celular e interferir con la diferenciación36. Además, se informó que la inhibición del VEGFR-2 en las células cancerosas desencadena la apoptosis, lo que aumenta sinérgicamente el efecto anticancerígeno37.

Para explorar la capacidad del inhibidor 10i de VEGFR-2 más potente para restaurar la apoptosis, se trataron células cancerosas HepG2 con el compuesto 10i durante 48 h a su concentración IC50. Se emplearon células HepG2 no tratadas como control negativo y los resultados se demuestran en la Tabla 4 y la Fig. 7. El derivado de quinolona 10i provocó un aumento significativo en las reacciones tempranas (2,43 % de la población celular), tardías (19,28 % de la población celular) y combinadas. cuartiles de apoptosis (21,72% de población celular). Los estudios también han informado de un perfil apoptótico similar, aunque un poco más débil, para el fármaco de referencia Sorafenib, donde se observó un 2,17 % de población celular en la fase apoptótica temprana, un 4,2 % en la fase apoptótica tardía y un 6,37 % en la apoptosis combinada38. Esto, a su vez, proporciona un sólido apoyo a la capacidad del compuesto 10i para reimponer la apoptosis en HepG2 y actuar como agente anticancerígeno.

Apoptosis en células HepG2 después de 48 h de exposición al compuesto 10i. Citogramas que presentan células HepG2 no tratadas teñidas con anexina V/yoduro de propidio como control negativo (A), células tratadas con el compuesto 10i (B) y representación de los resultados del análisis de apoptosis (C). Los gráficos de cuadrantes muestran Q2-1 (células necróticas, AV-/PI +), Q2-2 (células apoptóticas tardías, AV + /PI +), Q2-3 (células normales, AV-/PI-), Q2-4 ( células apoptóticas tempranas, AV + /PI-). Los datos representados son el promedio de ensayos experimentales por triplicado ± DE. *** se refiere a valores de p ≤ 0,0005.

Se utilizó citometría de flujo de ADN para analizar la cinética del ciclo celular de las células cancerosas HepG2 cuando se trataron previamente durante 48 h con el compuesto 10i a su concentración IC50. Las células HepG2 no tratadas se consideraron como control negativo. El ensayo resultó beneficioso para determinar las fases exactas del ciclo celular que se vieron afectadas con el compuesto objetivo 10i (Tabla 5, Fig. 8). De acuerdo con los resultados del ensayo de apoptosis, la aplicación del compuesto 10i provocó un profundo secuestro de células en Sub-G1(G0), lo que indica una actividad potenciadora de la apoptosis39, así como una acumulación de células en la fase G2, impidiendo así la progresión del ciclo celular a la fase G2. Fase M. Además, el compuesto disminuyó significativamente la frecuencia de las células en la fase S, interrumpiendo así la síntesis de ADN. El compuesto también provocó una notable disminución en la frecuencia de células que pasan a la fase G1 para continuar con el ciclo celular, disminuyendo así la progresión del ciclo. La búsqueda bibliográfica también reveló una gran similitud en la cinética del ciclo celular de las células HepG2 tras la aplicación del fármaco de referencia Sorafenib a su CI50 durante 48 h; El tratamiento único con sorafenib dio como resultado el secuestro de células en PreG1 (o Sub-G1 (G0)), así como la detención del crecimiento celular en la fase G2/M38.

Citogramas que muestran el análisis del ciclo celular de las células A549. (A) representa células HepG2 no tratadas (control), (B) representa células HepG2 después de 48 h de exposición al compuesto 10i (tratadas), (C) un gráfico que demuestra el porcentaje de población de células HepG2 en diferentes fases del ciclo celular. *** se refiere a valores de p ≤ 0,0005.

Se realizó RT-qPCR para evaluar la expresión genética relativa normalizada del gen VEGFR-2 en células cancerosas HepG2 cuando se trataron previamente durante 48 h con el compuesto 10i en su concentración IC50 utilizando células HepG2 no tratadas como control negativo. Los resultados mostraron una disminución notable en la expresión de VEGFR-2 tras la adición de nuestro compuesto quimioterapéutico 10i, por lo que disminuyó la expresión de VEGFR-2 en un 84 % (8,4 veces) en comparación con las células no tratadas (Fig. 9). En comparación con el fármaco de referencia Sorafenib, nuestro compuesto (10i) posee un exceso de actividad en las células HepG2. Por ejemplo, sorafenib es conocido por su capacidad para regular negativamente el VEGFR-2 en ciertos tipos de células cancerosas, incluidas A549 y Hela, pero no en las células HepG2, ya que sorafenib provocó una regulación positiva de VEGFR-2 cuando se introdujo en las células HepG240. Por lo tanto, se sugiere que 10i es más ventajoso para el carcinoma hepatocelular, donde causó una notable regulación negativa en la expresión de VEGFR-2 en células HepG2.

Datos de análisis de PCR en tiempo real que muestran la expresión relativa normalizada de VEGFR-2 después de la exposición de células HepG2 al compuesto 10i. Cada valor representa tres réplicas. El gen de β-actina se utilizó como gen de referencia para la normalización y para calcular la expresión relativa según el método 2-ΔΔCt41.

El probable efecto mecanicista del 10i se ha investigado más a fondo en los dos marcadores apoptóticos, Bax y Caspasa-7. Se seleccionaron Bax y Caspasa-7 como marcadores de apoptosis temprana y tardía, respectivamente42,43.

Se realizó una transferencia Western para evaluar la expresión proteica relativa normalizada de las proteínas apoptóticas Bax y Caspasa-7 en células cancerosas HepG2 cuando se trataron previamente durante 48 h con el compuesto 10i en su concentración IC50 en comparación con células HepG2 no tratadas. Se demostró una elevación significativa en la expresión de proteínas tanto de Bax como de Caspasa-7 en las células tratadas donde 10i indujo significativamente la expresión de proteínas de Bax y Caspasa-7 hasta 20 veces y 6 veces, respectivamente, en comparación con el grupo de control negativo (Fig. .10). Un estudio previo de Li et al. informaron hallazgos similares para el fármaco de referencia sorafenib con respecto a su capacidad para regular positivamente de manera significativa la expresión de caspasa-7 en células HepG2; sin embargo, no se informó ninguna regulación positiva significativa del marcador proapoptótico Bax44. Los hallazgos actuales proporcionan pruebas sólidas de la actividad apoptótica positiva del compuesto 10i en las células HepG2 que acompaña a su actividad inhibidora de la proliferación celular.

(A) Transferencias Western representativas para los niveles de HepG2 de Bax y Caspasa-7 en los grupos tratados y no tratados con el compuesto (10i). (B) Una representación de gráfico de barras para la expresión proteica relativa de Bax normalizada a niveles de β-actina. (C) Una representación de gráfico de barras para la expresión proteica relativa de Caspasa-7 normalizada a niveles de β-actina. Los datos se presentan como media ± DE (n = 3). El análisis estadístico se realizó mediante ANOVA unidireccional seguido de la prueba post hoc de Tukey-Kramer. *** indica una diferencia significativa frente al grupo de control en p < 0,001.

El modelado molecular es un método computacional utilizado para simular el comportamiento de moléculas dentro del sitio activo de objetivos biológicos. Debido al enorme aumento de los datos estructurales disponibles para las proteínas, así como a los importantes avances en el campo de las técnicas computacionales y el hardware, se desarrollaron metodologías de acoplamiento de alta precisión para ayudar en el proceso de varios pasos del diseño de fármacos45,46. Se realizaron estudios de acoplamiento para encajar las moléculas diseñadas en el sitio activo del VEGFR-2 (código PDB: 4ASD) para predecir su modo de unión plausible dentro de los residuos del sitio activo utilizando el software “Molecular Operating Environment” (MOE) versión 2019.01. El acoplamiento se realizó empleando el método de colocación del triángulo alfa, las posturas se priorizaron según la puntuación de afinidad London dG y el refinamiento de los resultados se realizó utilizando el campo de fuerza. Se registraron las puntuaciones de acoplamiento de las mejores poses (Tabla 6), así como sus interacciones dentro del sitio activo (datos no mostrados). Se descubrió que todos los compuestos sintetizados encajaban bien en el sitio activo de VEGFR-2 (PDB ID: 4ASD) con modos de unión similares a los de la molécula de referencia sorafenib. Las puntuaciones de acoplamiento de los miembros de esta serie estuvieron en el rango de -9,96 a -8,40 kcal/mol, siendo mejores que la puntuación de acoplamiento del fármaco de referencia sorafenib (puntuación S = -7,79 kcal/mol). En nuestro diseño, se utilizó un núcleo de quinolina carboxamida en el que el grupo amida en la posición 3 del núcleo de quinolina formaba un pseudo anillo de seis miembros con el grupo carbonilo en la posición 4; esto ayudó con la orientación correcta de los nuevos derivados a través del canal alostérico hacia la bolsa hidrofóbica dentro de la bolsa de VEGFR-2. Además, todos los compuestos mostraron una buena correlación entre los resultados del acoplamiento y la actividad inhibidora de VEGFR-2. Como ejemplo, en el presente documento se presentan los resultados del acoplamiento del compuesto 10i. 10i mostró la segunda mejor puntuación de acoplamiento -9,72 kcal/mol y formó interacciones clave con los aminoácidos del sitio activo de VEGFR-2 comparables a sorafenib donde la urea NH de 10i formó un enlace de hidrógeno con Glu 885, la urea C=O formó otro H El enlace con Asp 1046 y el anillo de fenilo central estuvo involucrado en una interacción pi-H con Phe 2047 (Fig. 11). El anillo de fenilo terminal que lleva el grupo isopropilo lipófilo encaja en el bolsillo trasero hidrófobo revestido con las cadenas laterales hidrófobas de Ile888, Leu889, Ile892, Leu1019 e Ile1044. Por tanto, la mayor afinidad de unión de 10i podría atribuirse al aumento de la interacción hidrofóbica con el bolsillo trasero. Estos resultados están en línea con la potente actividad inhibidora de VEGFR-2 de 10i (IC50 = 36 nM), lo que demuestra nuestra hipótesis y respalda nuestra estrategia de diseño.

Panel izquierdo: interacciones 2D de Sorafenib; panel derecho: interacciones 2D del compuesto 10i (PDB ID: 4ASD).

Las propiedades de absorción, distribución, metabolismo y excreción (ADME) del 10i se predijeron utilizando Biovia Discovery Studio. 10i mostró un perfil farmacocinético prometedor con una absorción GIT de buena a moderada; sin permeabilidad hematoencefálica, lo que indica la ausencia de posibles efectos secundarios en el SNC y sin inhibición del citocromo P450 2D6, lo que indica que no hay posibles interacciones farmacológicas. Los resultados se ilustran en la Tabla 7 y la Fig. 12.

Gráfico ADME para compuestos 10i.

Además, las propiedades similares a las de un fármaco para este compuesto se predijeron utilizando SWISS ADME (http://www.swissadme.ch/index.php) y los parámetros predichos se ilustran en la Tabla 8. Se predijo que 10i seguiría la regla de cinco de Lipinski con cero. violaciones que indican una buena biodisponibilidad oral, también se predijo que no sería un sustrato de glicoproteína P con bajo potencial de ser eliminado de las células cancerosas. Las alertas de subestructuras indeseables, como las alertas Pains y Brenk, no se predijeron para este compuesto, lo que indica que es específico.

En el estudio actual, se diseñaron y sintetizaron varias moléculas novedosas basadas en quinolona-3-carboxamida 10a-p. Todas las moléculas objetivo se probaron in vitro para determinar su actividad inhibidora de VEGFR-2 y su actividad citotóxica contra las células tumorales HepG2. En general, la mayoría de los compuestos dieron una actividad inhibidora de VEGFR-2 potente a moderada con una IC50 que oscilaba entre 36 nM y 0,578 µM en comparación con el fármaco de referencia sorafenib como fármaco de referencia con IC50 = 45 nM, mientras que siete compuestos mostraron una mejor actividad citotóxica que sorafenib. Los compuestos 10i y 10o exhibieron la mejor actividad inhibidora de VEGFR-2 con una potente actividad citotóxica contra la línea celular tumoral HepG2, por lo que se calculó su índice de selectividad mostrando su perfil de citotoxicidad tolerable. Como el inhibidor de VEGFR-2 más potente con alta citotoxicidad selectiva, el derivado 10i se llevó a cabo para futuras investigaciones mecanísticas como representante de esta serie de nuevas quinolonas. Se evaluaron el perfil de apoptosis de las células HepG2, el análisis del ciclo celular, los niveles de expresión de las proteínas Caspasa-7 y BAX y el nivel de expresión del gen VEGFR-2 tras el tratamiento de las células HepG2 con 10i y se encontró que estaban significativamente afectados por el tratamiento que favorecía la apoptosis de estas células cancerosas. Además, se realizó un estudio de acoplamiento in silico para predecir las posibles interacciones entre estas moléculas y los aminoácidos dentro del sitio de unión de VEGFR-2; los resultados coincidieron fundamentalmente con los datos biológicos. Además, la predicción in silico ADME de las propiedades farmacocinéticas y similares a las de 10i mostró resultados prometedores. Como conclusión, el compuesto 10i podría servir como un candidato adecuado para una mayor investigación como agente antiproliferativo que actúa mediante la inhibición de VEGFR-2.

Los puntos de fusión se determinaron usando el aparato Stuart SMP3 versión 5.0, usando el método de capilar abierto y no estaban corregidos. Los espectros infrarrojos se registraron en espectroscopía Shimadzu-FTIR utilizando discos KBR y se obtuvieron en número de onda (cm-1), Facultad de Farmacia, Universidad de El Cairo. Los espectros de 1H RMN se llevaron a cabo utilizando el espectrofotómetro Bruker en funcionamiento (400 MHz) en la Facultad de Farmacia de la Universidad Ain Shams o utilizando el espectrofotómetro JEOL (500 MHz) en el Centro Nacional de Investigación, en DMSO-d6 como disolvente y los desplazamientos químicos se dieron en δ. como partes por millón (ppm) a partir del tetrametilsilano (TMS) como estándar interno. Los espectros de RMN de 13C se obtuvieron utilizando el espectrofotómetro Bruker funcionando (100 MHz) en la Facultad de Farmacia de la Universidad Ain Shams o utilizando el espectrofotómetro JEOL (125 MHz) en el Centro Nacional de Investigación, en DMSO-d6 como disolvente y los desplazamientos químicos se dieron en δ como partes por millón (ppm) a partir de tetrametilsilano (TMS) como estándar interno. El microanálisis elemental se realizó en el centro regional de Micología y Biotecnología de la Universidad Al-Azhar. Las reacciones se controlaron mediante TLC (Merck, Alemania), se usó una mezcla de cloruro de metileno/metanol (9:1) como disolvente eluyente y las manchas se visualizaron mediante una lámpara ultravioleta. Todos los reactivos y disolventes se purificaron y secaron utilizando técnicas estándar. Todos los compuestos se denominaron químicamente utilizando la función de nombres químicos del software ChemDraw Ultra 12.0.

La anilina sustituida 1a o 1b (0,02 mol) se calentó con etoximetilenmalonato de dietilo (0,0216 mol, 4,67 g, 4,36 ml) a 125-135 °C durante 6 h, lo que provocó la liberación de etanol. Los correspondientes derivados de dietilanilinometilenmalonato 2a,b se produjeron como un aceite marrón que se enfrió hasta obtener un semisólido. El producto obtenido se purificó usando hexano, seguido de éter de petróleo y finalmente se dejó secar23,46,47,48.

Rendimiento: 78,5%; Pf: 63–65 °C según lo informado.

Rendimiento: 55,7%; Pf: 68–70 °C según lo informado.

El derivado de dietilanilinometilenmalonato 2a o 2b (0,015 mol) se calentó con éter difenilo (0,01 mol, 1,7 g, 1,5 ml) a 220 °C durante 1 h y luego se trasladó a un baño de arena durante 2 h. Se enfrió esta mezcla de reacción para proporcionar un precipitado que se separó por filtración, se lavó con hexano y luego con éter dietílico y se secó para proporcionar el 4-oxo-1,4-dihidroquinolin-3-carboxilato de etilo 6-sustituido 3a,b23,49.

Rendimiento: 62,7%; Pf: > 300 °C según lo informado.

Rendimiento: 44%; Pf: 273–275 °C según lo informado.

Una suspensión del éster de quinolona 6-sustituido 3a o 3b (0,01 mmol) en NaOH acuoso 1 M (60 ml) se sometió a reflujo durante 3 h. Después de enfriar hasta temperatura ambiente, esta mezcla se filtró usando un embudo Buchner. Luego se acidificó el filtrado usando HCl diluido. El precipitado formado se filtró y se lavó varias veces con agua y luego se dejó secar dando el ácido puro49,50.

Rendimiento: 67%; Pf: 260–262 °C según lo informado. RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 15,06 (s, 1H, COOH, D2O intercambiable), 8,91 (s, 1H, H-2-quinolina), 8,18 (d, J = 2,4 Hz, 1H, H -5-quinolina), 7,90 (dd, J = 8,8, 2,4 Hz, 1H, H-7-quinolina), 7,83 (d, J = 8,9 Hz, 1H, H-8-quinolina).

Rendimiento: 77,2%; Pf: 286–288 °C según lo informado. RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 15,13 (s, 1H, COOH, D2O intercambiable), 8,88 (s, 1H, H-5-quinolina), 7,85 rango (m, 2H, H-5 y H -8-quinolina), 7,76 (dt, J = 6,7, 1,95 Hz, 1H, H-7-quinolina).

Se disolvió azida sódica (2,86 g, 0,0441 mol) en 15 ml de agua y se enfrió en un baño de hielo. Se añadió gota a gota una solución de cloruro de 4-nitrobenzoilo (5) (5 g, 0,027 mol) disuelto en 15 ml de acetona seca durante 1 h. La mezcla de reacción se agitó durante 30 min seguido de la adición de 15 ml de agua y agitación continua durante otros 30 min. Se formará un precipitado que se recogerá mediante filtración seguido de lavado con agua y finalmente se secará para producir 4-nitrobenzoilazida (6) en forma de escamas ligeramente amarillas. Rendimiento: 60%; Punto de fusión: 71 °C según lo informado.

Refluya azida de 4-nitrobenzoilo (6) (3,84 g, 0,02 mmol) en 60 ml de tolueno seco durante 1 h para producir el isocianato de 4-nitrobenzoilo (7), que se empleó en la siguiente reacción como intermedio sin aislamiento ni purificación adicionales52. 53.

A una solución caliente de 0,02 mmol de 1-isocianato-4-nitrobenceno (7) en 60 ml de tolueno seco, se le añadieron 0,02 mmol de anilina sustituida y se sometió a reflujo durante 6 h. Se formó un precipitado y se filtró en caliente y luego se lavó con tolueno caliente para producir los derivados de 1-(4-nitrofenil)-3-fenilurea 8a-i.

Rendimiento: 99%; Pf: 207–209 °C según lo informado.

Rendimiento: 85%; Pf: 187–189 °C según lo informado.

Rendimiento: 92%; Mp: 199-2010C según lo informado.

Rendimiento: 91%; Pf: 195-197 °C.

Rendimiento: 89%; Pf: 249–251 °C según lo informado.

Rendimiento: 94%; Pf: 259–261 °C según lo informado.

Rendimiento: 90%; Pf: 289–291 °C según lo informado.

Rendimiento: 92%; Pf: 237–239 °C según lo informado.

Rendimiento: 91%; Pf: 218–220 °C.

Se disolvieron 18 g (0,075 moles) de sulfuro de sodio cristalizado, Na2S.9H2O, en 50 ml de agua; luego se añaden 6 g (0,0714 moles) de bicarbonato de sodio finalmente pulverizado en pequeñas porciones con agitación continua. Después de disolver todo el carbonato, se agregaron 50 ml de metanol y el carbonato de sodio precipitado se filtró mediante filtración al vacío. Se usaron tres porciones de 8 ml de metanol para lavar el precipitado. Se retuvieron el filtrado y los lavados, que contenían aproximadamente 3,9 g de sulfuro de hidrógeno sódico (NaHS) en solución y se utilizaron directamente después para la reducción. Se realizó la disolución de 0,015 moles de derivados de 1-(4-nitrofenil)-3-arilurea 8a-i en 50 ml de metanol en caliente seguido de la adición con agitación de la mitad de la solución metanólica de sulfuro de hidrógeno sódico previamente preparada, a reflujo durante 16 h. . se hizo ignorando cualquier carbonato de sodio adicional que pudiera precipitar. La mezcla de reacción se dejó enfriar y luego se filtró para recoger el precipitado. Para la purificación del producto; el precipitado se disolvió en dil. HCl, filtrado usando un embudo Buchner, el filtrado se neutralizó usando NaHCO3 dando como resultado la reprecipitación de los derivados puros de 1-(4-aminofenil)-3-arilurea 9a-i que se recogieron mediante filtración y se secaron.

Rendimiento: 21%; Pf: 224-227 °C; RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 8,47 (s, 1H, NH, D2O intercambiable), 8,13 (s, 1H, NH, D2O intercambiable), 7,41 (d, J = 7,7 Hz, 2H, Ar– H), 7,22 (t, J = 7,8 Hz, 2H, Ar–H), 7,07 (d, J = 8,6 Hz, 2H, Ar–H), 6,90 (t, J = 7,3 Hz, 1H, Ar–H) , 6,51 (d, J = 8,7 Hz, 2H, Ar–H), 4,76 (s, 2H, NH2, D2O intercambiable).

Rendimiento: 28%; Pf: > 300°C; RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 8,36 (s, 1H, NH, D2O intercambiable), 8,08 (s, 1H, NH, D2O intercambiable), 7,29 (d, J = 8,0 Hz, 2H, Ar– H), 7,04 (m, 4H, Ar–H), 6,49 (d, J = 8,3 Hz, 2H, Ar–H), 4,74 (s, 2H, NH2, D2O intercambiable), 2,22 (s, 3H, -CH3 ).

Rendimiento: 36,3%; Pf: > 300°C; RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6) δ 8,39 (s, 1H, NH, D2O intercambiable), 8,11 (s, 1H, NH, D2O intercambiable), 7,26 (s, 1H, Ar–H), 7,18 (d, J = 8,8 Hz, 1H, Ar–H), 7,10 (t, J = 7,7 Hz, 1H, Ar–H), 7,05 (d, J = 8,7 Hz, 2H, Ar–H), 6,73 (d, J = 7,4 Hz, 1H, Ar–H), 6,49 (d, J = 8,7 Hz, 2H, Ar–H), 4,79 (s, 2H, NH2, D2O intercambiable), 2,25 (s, 3H, -CH3).

Rendimiento: 30,55%; Pf: > 300°C; RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 8,54 (s, 1H, NH, D2O intercambiable), 7,84 (d, J = 8,4 Hz, 1H, Ar–H), 7,72 (s, 1H, NH, D2O intercambiable), 7,10 (m, 7,6 Hz, 2H, Ar–H), 7,07 (d, J = 8,8 Hz, 2H, Ar–H), 6,87 (m, 1H, Ar–H), 6,50 (d, J = 8,8 Hz, 2H, Ar–H), 4,77 (s, 2H, NH2, D2O intercambiable), 2,21 (s, 3H, -CH3).

Rendimiento: 30%; Pf: 273-275 °C; RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 8,70 (s, 1H, NH, D2O intercambiable), 8,28 (s, 1H, NH, D2O intercambiable), 7,45–7,41 (m, 2H, Ar–H), 7,10–7,05 (m, 4H, Ar–H), 6,52–6,50 (m, 2H, Ar–H), 4,74 (s, 2H, NH2, D2O intercambiable).

Rendimiento: 6,1%; Pf: 147-149 °C; RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 9,34 (s, 1H, NH, D2O intercambiable), 8,75 (s, 1H, NH, D2O intercambiable), 8,04 (s, 1H, Ar–H), 7,58 ( d, J = 8,3 Hz, 1H, Ar–H), 7,41 (t, J = 7,9 Hz, 1H, Ar–H), 7,21 (d, J = 7,8 Hz, 1H, Ar–H), 7,11 (d, J = 8,3 Hz, 2H, Ar–H), 6,48 (d, J = 8,2 Hz, 2H, Ar–H), 4,77 (s, 2H, NH2, D2O intercambiables).

Rendimiento: 21%; Pf: 217-219 °C; RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 9,3 (s, 1H, NH, D2O intercambiable), 8,79 (s, 1H, NH, D2O intercambiable), 7,74 (d, J = 8,9 Hz, 2H, Ar– H), 7,53 (d, J = 8,8 Hz, 2H, Ar–H), 7,13 (d, J = 8,3 Hz, 2H, Ar–H), 6,47 (d, J = 8,9 Hz, 2H, Ar–H) , 4,75 (s, 2H, NH2, D2O intercambiables).

Rendimiento: 33%; Pf: > 300°C; RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 9,19 (s, 1H, NH, D2O intercambiable), 8,89 (s, 1H, NH, D2O intercambiable), 8,35 (m, 2H, H-2 y H-7 benzo[d]tiazol), 7,95 (d, J = 8,8 Hz, 1H, H-4 benzo[d]tiazol), 7,45 (d, J = 8,9 Hz, 1H, H-5 benzo[d]tiazol), 7,10 (d, J = 8,3 Hz, 2H, Ar–H), 6,52 (d, J = 8,2 Hz, 2H, Ar–H), 4,81 (s, 1H, -NH, D2O intercambiable), 4,78 (s, 1H, NH, D2O intercambiable).

Rendimiento: 5%; Pf: 183ºC; RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 8,43 (s, 1H, NH, D2O intercambiable), 8,14 (s, 1H, NH, D2O intercambiable), 7,31 (d, J = 8,1 Hz, 2H, Ar– H), 7,13–7,06 (m, 4H, Ar–H), 6,49 (d, J = 8,3 Hz, 2H, Ar–H) C6H4), 4,76 (s, 1H, NH, D2O intercambiable), 4,73 (s, 1H, NH, D2O intercambiable) 2,84–2,77 (m, 1H, -CH(CH3)2), 1,16 (d, J = 7,0 Hz, 6H, -CH(CH3)2).

El ácido quinolincarboxílico 4a o 4b (1,0 mmol) se agita con HATU (1,5 mmol) y diisopropiletilamina (3 mmol) en dimetilformamida anhidra durante 1 h en un baño de hielo (0 °C). A continuación se añadió la correspondiente amina 9a-i (1,5 mmol). La mezcla se dejó durante la noche a temperatura ambiente con agitación continua. La mezcla se vertió lentamente sobre agua helada para formar un precipitado que se filtró y se sometió a lavados secuenciales con acetato de etilo, etanol y finalmente metanol para producir los compuestos objetivo finales 10a-p. (Los gráficos de IR, 1H NMR y 13C NMR para análisis espectrales para derivados 10a-p se proporcionan en el material complementario, Figuras S1-S45).

Precipitado fino de color naranja amarillento pálido; Rendimiento: 62,5%; Pf: > 300 °C. IR (KBr, cm−1): 3398–3263 (4 NH), 3086 (CH aromático), 1674–1650 (3 C=O). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 12,22 (s, 1H, CONH, D2O intercambiable), 8,90 (s, 1H, H-2-quinolina), 8,64 (s, 2H,2NH, D2O intercambiable), 8,25 (s, 1H, H-5 quinolina), 7,83 (d, J = 9,1 Hz, 1H, quinolina H-7), 7,79 (d, J = 9,0 Hz, 1H, quinolina H-8), 7,64 (d, J = 9,1, 2H, Ar–H), 7,46 – 7,44 (m, 4H, Ar–H), 7,30 – 7,26 (m, 2H, Ar–H), 6,94 (t, J = 9,2 Hz, 1H, Ar–H). RMN de 13C (101 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 175,04, 162,17, 152,57, 144,59, 139,79, 138,12, 135,41, 133,10, 132,89, 129,79, 128,76 (2C), 127,05, 124,37, 121,84, 121,72, 120,20 (2C) , 118,86 (2C), 118,15(2C), 111,01. Anal. Calculado para C23H17ClN4O3 (432,86): C, 63,82; H, 3,96; N, 12,94.; Encontrado: C, 64,05; H, 4,12; N, 13.18.

Precipitado amarillo; Rendimiento: 32,8%; Pf: > 300 °C. IR (KBr, cm-1): 3275 (br., 4 NH), 3062 (CH aromático), 2962 (CH alifático), 1654–1639 (3 C = O). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 12,19 (s, 1H, CONH, D2O intercambiable), 8,89 (s, 1H, H-2-quinolina), 8,57 (s, 1H, NH, D2O intercambiable), 8,51 (s, 1H, NH, D2O intercambiable), 8,23 (d, J = 2,3 Hz, 1H, H-5 quinolina), 7,81 (dd, J = 8,6, 2,3 Hz, 1H, H-7 quinolina), 7,76 ( d, J = 8,9 Hz, 1H, quinolina H-8), 7,63 (d, J = 8,5 Hz, 2H, Ar–H), 7,43 (d, J = 8,4 Hz, 2H, Ar–H), 7,33 (d , J = 8,0 Hz, 2H, Ar–H),7,07 (d, J = 8,0 Hz, 2H, Ar–H),2,24 (s, 3H, CH3). RMN de 13C (101 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 175,07, 162,10, 152,61, 144,47, 137,96, 137,20, 135,53, 132,98, 130,53, 129,83 (2C), 129,15 (2C), 127. 03, 124,38, 121,73, 120,19 (2C ), 118,78 (2C), 118,25 (2C), 111,05, 20,32. Anal. Calculado para C24H19ClN4O3 (446,89): C, 64,50; H, 4,29; N, 12,54. Encontrado: C, 64,29; H, 4,53; N, 12,79.

precipitado color beige; Rendimiento: 23,88%; Pf: > 300 °C. IR (KBr, cm-1): 3348 (br., 4 NH), 3082 (CH aromático), 3966 (CH alifático), 1670–1651 (3 C = O). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 12,20 (s, 1H, CONH, D2O intercambiable), 8,88 (s, 1H, H-2-quinolina), 8,61 (s, 1H, NH, D2O intercambiable), 8,55 (s, 1H, NH, D2O intercambiable), 8,23 (d, J = 2,4 Hz, 1H, H-5 quinolina), 7,80 (dd, J = 8,7, 2,5 Hz, 1H, H-7 quinolina), 7,76 ( d, J = 9,0 Hz, 1H, quinolina H-8), 7,63 (d, J = 8,6 Hz, 2H, Ar–H), 7,44 (d, J = 8,8 Hz, 2H, Ar–H), 7,30 (s , 1H, Ar–H), 7,22 (d, J = 8,2 Hz, 1H, Ar–H), 7,13 (t, J = 7,8 Hz, 1H, Ar–H), 6,77 (d, J = 7,4 Hz, 1H , Ar–H), 2,28 (s, 3H, CH3). RMN 13C (101 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 175,07, 162,11, 152,54, 144,45, 139,69, 137,96, 137,91, 135,44, 133,05, 132,92, 129,82, 128,59, 1 27.02, 124.38, 122.47, 121.72, 120.19 (2C), 118,82 (2C), 118,67, 115,33, 111,04, 21,23. Anal. Calculado para C24H19ClN4O3 (446,89): C, 64,50; H, 4,29; N, 12,54. Encontrado: C, 64,34; H, 4,50; N, 12,76.

Precipitado amarillo; Rendimiento: 37,3%; Pf: > 300 °C. IR (KBr, cm-1): 3282 (br., 4 NH), 3082 (CH aromático), 2962 (CH alifático), 1660–1639 (3 C = O). RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 12,23 (s, 1H, CONH, D2O intercambiable), 9,02 (s, 1H, NH, D2O intercambiable), 8,89 (s, 1H, H-2-quinolina), 8,23 (s, 1H, H-5 quinolina), 7,91 (s, 1H, NH, D2O intercambiable), 7,86 – 7,82 (m, 2H. H-7 y H-8-quinolina), 7,78 (m, 1H, Ar –H), 7,64 (d, J = 8,9 Hz, 2H, Ar–H), 7,45 (d, J = 8,6 Hz, 2H, Ar–H), 7,17–7,12 (m, 2H, Ar–H), 6,95 –6,92 (m, 1H, Ar–H), 2,24 (s, 3H, CH3). RMN 13C (126 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 175,05, 162,13, 152,67, 144,50, 138,04, 137,46, 135,59, 132,97, 132,96, 130,14, 129,79, 127,45, 1 27,03, 126,11, 124,36, 122,57, 121,78, 121,01, 120,24 (2C), 118,65 (2C), 111,04, 17,83. Anal. Calculado para C24H19ClN4O3 (446,89): C, 64,50; H, 4,29; N, 12,54. Encontrado: C, 64,59; H, 4,38; N, 12,68.

Precipitado de color amarillo claro; Rendimiento: 29,6%; Pf: > 300 °C. IR (KBr, cm−1): 3290 (br., 4 NH), 3082–3008 (CH aromático), 1659–1636 (3 C=O). RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 12,26 (s, 1H, CONH, D2O intercambiable), 8,90 (s, 1H, H-2-quinolina), 8,70 (s, 1H, NH, D2O intercambiable), 8,65 (s, 1H, NH, D2O intercambiable), 8,23 (d, J = 2,4 Hz, 1H, H-5-quinolina), 7,81 (dd, J = 8,7, 2,5 Hz, 1H, H-7-quinolina), 7,77 (d, J = 9,0 Hz, 1H, H-8-quinolina), 7,64 (d, J = 8,6 Hz, 2H, Ar–H), 7,48–7,43 (m, 4H, Ar–H), 7,13–7,09 (m, 2H, Ar–H). RMN 13C (101 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 175,07, 162,25, 152,71, 144,67, 138,22, 136,14, 135,39, 133,17, 129,83, 127,10, 124,40, 121,93, 1 20,23 (2C), 120,01, 119,93 (2C), 118,99 (2C), 115,39 (2C), 115,17, 111,03. Anal. Calculado para C23H16ClFN4O3 (450,85): C, 61,27; H, 3,58; N, 12,43. Encontrado: C, 61,43; H, 3,7; N, 12,71.

Precipitado amarillo; Rendimiento: 61%; Pf: > 300 °C. IR (KBr, cm-1): 3429–3259 (4 NH), 3093 (CH aromático), 1670 (br., 3 C = O). RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 12,23 (s, 1H, CONH, D2O intercambiable), 9,03 (s, 1H, NH, D2O intercambiable), 8,90 (s, 1H, H-2-quinolina), 8,78 (s, 1H, NH, D2O intercambiable), 8,24 (s, 1H, H-5-quinolina), 8,02 (s, 1H, Ar–H), 7,84 (d, J = 9,0 Hz, 1H, H-7 -quinolina), 7,78 (d, J = 8,8 Hz, 1H, H-8-quinolina), 7,65 (d, J = 8,4 Hz, 2H, Ar–H), 7,56 (d, J = 8,3 Hz, 1H, Ar –H), 7,49 (m, 1H, Ar–H), 7,45 (d, J = 8,4 Hz, 2H, Ar–H), 7,30 (d, J = 7,8 Hz, 1H, Ar–H). RMN 13C (126 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 175,17, 162,22, 155,76, 152,60, 152,19, 147,99, 144,52, 140,72, 137,98, 135,07, 133,44, 133,05, 1 29,93, 127,10, 124,45, 121,83, 121,82, 120,25 (2C ), 119,32 (2C), 118,04, 114,16, 111,12. Anal. Calculado para C24H16ClF3N4O3 (500,86): C, 57,55; H, 3,22; N, 11.19. Encontrado: C, 57,81; H, 3,49; N, 11.42.

Precipitado marrón; Rendimiento: 48,5%; Pf: > 300 °C. IR (KBr, cm−1): 3356–3271 (4 NH), 3078 (CH aromático), 2225 (CN), 1658–1640 (3 C=O). RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 12,25 (s, 1H, CONH, D2O intercambiable), 8,93 (s, 1H, NH, D2O intercambiable), 8,90 (s, 1H, NH, D2O intercambiable), 8,76 (s, 1H, H-2-quinolina), 8,24 (s, 1H, H-5-quinolina), 7,85–7,77 (m, 4H, Ar–H), 7,67 – 7,64 (m, 2H, H-7 y H-8-quinolina), 7,51 (d, J = 6,8 Hz, 2H, Ar–H), 7,46 (d, J = 6,8 Hz, 2H, Ar–H). RMN 13C (126 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 175,05, 167,54, 162,24, 152,35, 144,65, 142,59, 138,19, 135,11, 133,24, 132,89, 129,79 (2C), 128,50 , 127,07, 124,37, 121,91, 120,21 (2C) , 119,09 (2C), 118,01, 117,04 (2C), 111,00. Anal. Calculado para C24H16ClN5O3 (457,87): C, 62,96; H, 3,52; N, 15.30. Encontrado: C, 62,83; H, 3,71; N, 15,48.

precipitado color beige; Rendimiento: 81%; Pf: > 300 °C. IR (KBr, cm−1): 3417–3282 (4 NH), 3074 (CH aromático), 1708–1654 (3 C=O). RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 12,47 (s, 1H, CONH, D2O intercambiable), 9,20 (s, 1H, H-2-quinolina), 8,95 (s, 1H, NH, D2O intercambiable), 8,90 (s, 1H, NH, D2O intercambiable), 8,74 (s, 1H, H-2 benzo[d]tiazol), 8,37 (d, J = 2,0 Hz, 1H, H-5-quinolina), 8,23 (d, J = 2,3 Hz, 1H, H-7-quinolina), 7,97 (d, J = 8,8 Hz, 1H, H-8-quinolina), 7,78 – 7,65 (m, 4H, Ar–H), 7,49–7,45 (m , 3H, H-4, H-5, H-7-benzo[d]tiazol). RMN 13C (126 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 174,70, 162,82, 153,68, 152,67, 148,29, 145,93, 137,71, 135,06 , 134,50, 133,54, 132,34, 129,33, 127,36, 124,27, 123,13, 122,96, 120,16 (2C), 119,21 (2C), 119,08, 118,16, 110,71, 110,28. Anal. Calculado para C24H16ClN5O3S (489,93): C, 58,84; H, 3,29; N, 14,29; S, 6,54. Encontrado: C, 59,12; H, 3,46; norte, 14,58; S, 6,63.

Precipitado marrón; Rendimiento: 48%; Pf: > 300 °C. IR (KBr, cm-1): 3317 (br., 4 NH), 3043–3001 (CH aromático), 3958 (CH alifático), 1651 (br., 3 C = O). RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 12,22 (s, 1H, CONH, D2O intercambiable), 8,90 (s, 1H, H-2-quinolina), 8,60 (s, 1H, NH, D2O intercambiable), 8,55 (s, 1H, NH, D2O intercambiable), 8,24 (d, J = 2,5 Hz, 1H, H-5-quinolina), 7,84 (dd, J = 8,8, 2,5 Hz, 1H, H-7-quinolina), 7,78 (d, J = 8,8 Hz, 1H, H-8-quinolina), 7,63 (d, J = 8,6 Hz, 2H, Ar–H), 7,42 (d, J = 8,7 Hz, 2H, Ar–H), 7,35 (d, J = 8,3 Hz, 2H, Ar–H), 7,13 (d, J = 8,3 Hz, 2H, Ar–H), 2,85–2,79 (m, 1H, -CH(CH3)2), 1,17 ( d, J = 6,9 Hz, 6H, -CH(CH3)2). RMN 13C (126 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 175,14, 162,20, 152,69, 144,59, 141,89, 138,10, 137,49, 135,59, 133,00, 129,89, 127,87, 127,12, 1 26,51(2C), 124,44, 121,86, 120,27 (2C) , 118,87 (2C), 118,44 (2C), 111,12, 32,80, 24,05 (2C). Anal. Calculado para C26H23ClN4O3 (474,94): C, 65,75; H, 4,88; Norte, 11,80. Encontrado: C, 65,92; H, 4,95; N, 11,97.

Precipitado fino de color amarillo brillante; Rendimiento: 36,8%; Pf: > 300 °C. IR (KBr, cm-1): 3271 (br., 4 NH), 3097 (CH aromático), 1685-1651 (3 C = O). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 12,25 (s, 1H, CONH, D2O intercambiable), 8,86 (s, 1H, H-2-quinolina), 8,62 (s, 2H, NH, D2O intercambiable), 7,93 (d, J = 9,0 Hz, 1H, H-5-quinolina), 7,80–7,69 (m, 2H, H-7 y H-8-quinolina), 7,63 (d, J = 8,5 Hz, 2H, Ar– H), 7,46–7,44 (m, 4H, Ar–H), 7,25 (t, J = 7,5 Hz, 2H, Ar–H), 6,94 (t, J = 7,3 Hz, 1H, Ar–H). RMN de 13C (101 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 175,48, 162,36, 158,18, 152,67, 144,05, 139,82, 136,03, 135,45, 133,20, 128,85 (2C), 127,40, 122,14, 121. 84, 120,27 (2C), 118,98 (2C), 118,27 (2C), 110,27, 109,87, 109,64. Anal. Calculado para C23H17FN4O3 (416,40): C, 66,34; H, 4,11; N, 13.45. Encontrado: C, 66,23; H, 4,37; N, 13,69.

Precipitado amarillo; Rendimiento: 46,8%; Pf: > 300 °C. IR (KBr, cm-1): 3360–3221 (4 NH), 3070 (CH aromático), 2985 (CH alifático), 1660–1651 (3 C = O). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 12,24 (s, 1H, CONH, D2O intercambiable), 8,85 (s, 1H, H-2-quinolina), 8,58 (s, 1H, NH, D2O intercambiable), 8,52 (s, 1H, NH, D2O intercambiable), 7,93 (d, J = 9,0 Hz, 1H, H-5-quinolina), 7,80–7,68 (m, 2H, H-7 y H-8-quinolina), 7,63 (d, J = 8,6 Hz, 2H, Ar–H), 7,43 (d, J = 8,4 Hz, 2H, Ar–H), 7,33 (d, J = 8,0 Hz, 2H, Ar–H), 7,06 (d , J = 7,9 Hz, 2H, Ar–H), 2,23 (s, 3H, -CH3). RMN 13C (101 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 175,46, 162,33, 152,71, 144,02, 137,24, 136,04, 135,55, 133,11, 130,64, 129,22 (2C), 122,22, 121,88 , 121,63, 120,25 (2C), 118,89 (2C) ), 118,36 (2C), 110,27, 109,85, 109,62, 20,37. Anal. Calculado para C24H19FN4O3 (430,43): C, 66,97; H, 4,45; N, 13.02. Encontrado: C, 66,71; H, 4,60; N, 13.28.

Precipitado amarillo; Rendimiento: 54,6%; Pf: > 300 °C. IR (KBr, cm-1): 3414–3263 (4 NH), 3097 (CH aromático), 2981 (CH alifático), 1670 (br., 3 C = O). RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 12,29 (s, 1H, CONH, D2O intercambiable), 8,90 (s, 1H, H-2-quinolina), 8,62 (s, 1H, NH, D2O intercambiable) , 8,57 (s, 1H, , NH, D2O intercambiable), 7,96 (dd, J = 9,1, 3,0 Hz, 1H, , H-5-quinolina), 7,83 (dd, J = 9,1, 4,6 Hz, 1H, H- 8-quinolina), 7,71 (td, J = 8,6, 3,0 Hz, 1H, H-7-quinolina), 7,63 (d, J = 8,9 Hz, 2H, Ar–H), 7,43 (d, J = 8,9 Hz, 2H, Ar–H), 7,30 (s, 1H, Ar–H), 7,22 (d, J = 7,7 Hz, 1H, Ar–H), 7,13 (t, J = 7,7 Hz, 1H, Ar–H), 6,77 (d, J = 7,4 Hz, 1H, Ar–H), 2,27 (s, 3H, -CH3). RMN 13C (101 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 175,55, 162,36, 152,68, 146,83, 144,06, 139,74, 138,05, 136,00, 135,52, 133,16, 128,72, 122,64, 1 22,16, 120,31(2C), 118,99 (2C), 118,82 , 115,48, 110,96, 110,31, 109,90, 109,68, 21,31. Anal. Calculado para C24H19FN4O3 (430,43): C, 66,97; H, 4,45; N, 13.02. Encontrado: C, 66,88; H, 4,63; N, 13.19.

Precipitado de color amarillo pálido; Rendimiento: 46,8%; Pf: > 300 °C. IR (KBr, cm-1): 3271 (4 NH), 3059 (CH aromático), 2978 (CH alifático), 1647 (br., 3 C = O). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 12,26 (s, 1H, CONH, D2O intercambiable), 8,98 (s, 1H, NH, D2O intercambiable), 8,89 (s, 1H, H-2-quinolina), 7,95 (dd, J = 9,2, 3,0 Hz, 1H, H-5 quinolina), 7,88 (s, 1H, NH, D2O intercambiable), 7,85–7,82 (m, 2H, H-8-quinolina y Ar–H), 7,70 (td, J = 8,6, 3,0 Hz, 1H, H-7-quinolina), 7,64 (d, J = 9,0 Hz, 2H, Ar–H), 7,44 (d, J = 8,5 Hz, 2H, Ar– H), 7,18–7,12 (m, 2H, Ar–H), 6,92 (t, J = 7,4 Hz, 1H, Ar–H), 2,25 (s, 3H, -CH3). RMN 13C (101 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 175,47, 162,31, 152,73, 144,09, 143,46, 137,49, 135,62, 133,03, 130,21, 127,50, 127,15, 126,19, 1 22,65, 122,27, 121,04, 120,27(2C), 118,71( 2C), 115,46, 112,96, 110,25, 109,62, 17,91. Anal. Calculado para C24H19FN4O3 (430,43): C, 66,97; H, 4,45; N, 13.02. Encontrado: C, 67,04; H, 4,61; N, 13.27.

Precipitado amarillo; Rendimiento: 51%; Pf: > 300 °C. IR (KBr, cm−1): 3375–3221 (4 NH), 3074 (CH aromático), 1685–1651 (3 C=O). RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 12,28 (s, 1H, CONH, D2O intercambiable), 8,88 (s, 1H, H-2-quinolina), 8,69 (s, 1H, NH, D2O intercambiable), 8,64 (s, 1H, 1NH, D2O intercambiable), 7,95–7,71 (m, 3H, H-5, H-7 y H-8-quinolina), 7,65 (m, 2H, Ar–H), 7,46 (m, 4H, Ar–H), 7,12 (m, 2H, Ar–H). RMN de 13C (126 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 175,46, 162,36, 152,74, 144,13, 136,16, 135,40, 133,24, 127,42, 122,28, 121,85, 120,24 (2C), 120,03 (2C), 119,97, 119,03 (2C), 115,37 (2C), 115,19, 110,27, 109,81, 109,63. Anal. Calculado para C23H16F2N4O3 (434,39): C, 63,59; H, 3,71; N, 12,90. Encontrado: C, 63,72; H, 3,85; N, 13.18.

Precipitado amarillo; Rendimiento: 42%; Pf: > 300 °C. IR (KBr, cm−1): 3271–3236 (4 NH), 3066 (CH aromático), 1670–1650 (3 C=O). RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 12,28 (s, 1H, CONH, D2O intercambiable), 9,04 (s, 1H, NH, D2O intercambiable), 8,88 (s, 1H, H-2-quinolina), 8,77 (s, 1H, NH, D2O intercambiable), 8,03 (s, 1H, Ar–H), 7,94 (dd, J = 9,2, 2,9 Hz, 1H, H-5-quinolina), 7,80 (dd, J = 9,1 , 4,6 Hz, 1H, H-8-quinolina), 7,73–7,69 (m, 1H, H-7-quinolina), 7,65 (d, J = 8,4 Hz, 2H, Ar–H), 7,56 (d, J = 8,1 Hz, 1H, Ar–H), 7,51–7,48 (m, 1H, Ar–H), 7,45 (d, J = 8,5 Hz, 2H, Ar–H), 7,28 (d, J = 7,8 Hz, 1H, Ar–H). RMN 13C (126 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 175,59, 162,46, 160,47, 158,53, 152,71, 144,15, 140,84, 136,11, 135,14, 133,61, 130,01, 127,46, 1 22,30, 122,24, 121,93, 120,33 (2C), 119,43 ( 2C), 118,10, 114,28, 110,38, 109,93, 109,75. Anal. Calculado para C24H16F4N4O3 (484,40): C, 59,51; H, 3,33; N, 11,57. Encontrado: C, 59,78; H, 3,45; N, 11.

precipitado color beige; Rendimiento: 64 %, pf: > 300 °C. IR (KBr, cm-1): 3309–3224 (4 NH), 3055 (CH aromático), 2954 (CH alifático), 1680–1643 (3 C = O). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 12,25 (s, 1H, CONH, D2O intercambiable), 8,88 (s, 1H, H-2-quinolina), 8,57 (s, 1H, NH, D2O intercambiable), 8,52 (s, 1H, NH, D2O intercambiable), 7,95 (dd, J = 9,1, 3,0 Hz, 1H, H-5-quinolina), 7,82 (dd, J = 9,1, 4,7 Hz, 1H, H-8-quinolina ), 7,70 (dt, J = 10,3, 5,1 Hz, 1H, H-7-quinolina), 7,63 (d, J = 8,4 Hz, 2H, Ar–H), 7,43 (d, J = 8,5 Hz, 2H, Ar –H), 7,35 (d, J = 8,2 Hz, 2H, Ar–H), 7,13 (d, J = 8,1 Hz, 2H, Ar–H), 2,84- 2,81(m, 1H, -CH(CH3)2 ), 1,19–1,17 (d, J = 6,9 Hz, 6H, -CH(CH3)2). RMN 13C (126 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 175,42, 162,24, 152,62, 144,00, 141,81, 137,42, 135,96, 135,50, 133,02, 127,34, 126,44 (2C), 122,10 , 121,86, 120,18 (2C), 118,80 (2C ), 118,38 (2C), 110,24, 109,77, 109,76, 32,74, 23,99 (2C). Anal. Calculado para C26H23FN4O3 (458,48): C, 68,11; H, 5,06; N, 12.22. Encontrado: C, 67,94; H, 5,23; N, 12,46.

El kit de ensayo de quinasa VEGFR-2 se obtuvo para medir la actividad de la quinasa VEGFR-2 utilizando Kinase-Glo MAX como reactivo de detección. El kit de ensayo de quinasa VEGFR-2 (BPS Bioscience, n.º de catálogo 40325) se recibe en un formato conveniente de 96 pocillos, acompañado de enzima VEGFR-2 recombinante purificada, sustrato de VEGFR-2 además de ATP y tampón quinasa 1 para usar en 100 reacciones enzimáticas2,34. En este ensayo, la actividad quinasa se obtiene midiendo la cantidad de ATP que queda en la solución después de una reacción quinasa como un tipo de ensayo de quinasa luminiscente. Existe una correlación directa entre la señal luminiscente y la cantidad de ATP presente con una correlación inversa con la cantidad de actividad quinasa. El protocolo de ensayo comienza con la descongelación de 5 × Kinase Buffer 1, ATP y 50 × sustrato PTK. La mezcla maestra se preparó (25 ml por pocillo) de la siguiente manera: N pocillos x (6 µl 5 × tampón quinasa 1 + 1 µl de ATP (500 µM) + 1 µl 50 × sustrato PTK + 17 µl de agua). Adición de 5 µl de solución inhibidora para los pocillos denominados “Test Inhibitor”. Se agregaron 5 μL de la misma solución sin la adición de inhibidor (tampón inhibidor) tanto para el "Control positivo" como para el "Blanco". Preparación de 3 ml de 1 × Kinase Buffer 1 mezclando 600 μL de 5 × Kinase Buffer 1 con 2400 µl de agua; estos 3 ml de 1 × Kinase Buffer 1 fueron suficientes para realizar 100 reacciones. Agregue 20 μL de 1 × Kinase Buffer 1 al pocillo designado para "Blanco". Descongelación de la enzima VEGFR-2 en hielo, seguido de cálculo la cantidad de VEGFR-2 necesaria para esta prueba y luego diluir la enzima a 1 ng/μL usando 1 × Tampón Quinasa 1. Iniciar la reacción agregando 20 μL de la enzima VEGFR-2 diluida a los pocillos del “Control Positivo” y también los pocillos "Test Inhibitor Control" y luego se incubaron a 30 °C durante 45 min. Esto fue seguido por la adición de 50 µL de reactivo Kinase-Glo Max en todos los pocillos en 45 min. Se cubren las placas con papel de aluminio para incubar. durante 15 min a temperatura ambiente, al final se midió la luminiscencia utilizando el lector de microplacas Bioline ELISA a una longitud de onda de 450 nm. Se utilizó el software informático Graphpad Prism para analizar los datos de luminiscencia. La diferencia entre las intensidades de luminiscencia en ausencia de VEGFR (Lut) y en presencia de VEGFR (Luc) se definió como 100% de actividad (Lut – Luc). Usando la señal de luminiscencia (Lu) en presencia del compuesto, el % de actividad se calculó como: % de actividad = {(Lut—Lu)/(Lut—Luc) × 100%, donde Lu = la intensidad de luminiscencia en presencia del compuesto . El % de inhibición se calculó como: % de inhibición = 100 (%) ˗ % de actividad. Se calculó la determinación de IC50 para los compuestos diana contra VEGFR-2. Luego se representaron los valores de % de actividad frente a una serie de concentraciones de compuestos (10 μM, 1 μM, 0,1 μM y 0,01 μM) utilizando un análisis de regresión no lineal de la curva dosis-respuesta sigmoidal generada con la ecuación: Y = B + (TB )/1 + 10((LogEC50-X) × Hill Slope), donde Y = porcentaje de actividad, B = porcentaje mínimo de actividad, T = porcentaje máximo de actividad, X = logaritmo del compuesto y Hill Slope = factor de pendiente o coeficiente de Hill. El valor de CI50 se determinó mediante la concentración que provocaba un porcentaje de actividad la mitad del máximo61,63,64.

Utilizando el método del bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT); Los efectos citotóxicos de los nuevos derivados de quinolona se investigaron in vitro contra células de carcinoma hepatocelular humano (HepG2) (compradas en ATCC). El método MTT es un método preciso que proporciona resultados reproducibles. Se utilizó sorafenib como estándar de referencia. Las soluciones de MTT se prepararon en soluciones salinas medias o equilibradas sin rojo de fenol para producir un color amarillento. El principio de este ensayo se basa en que las deshidrogenasas mitocondriales de las células viables escinden el anillo de tetrazolio, produciendo cristales de formazán de color púrpura que son insolubles en soluciones acuosas. A continuación, los cristales producidos se disolvieron en isopropanol acidificado. Medición espectrofotométrica de la solución púrpura producida que refleja el grado de citotoxicidad causada por los compuestos de prueba65. Se debe incluir un blanco que contenga medio completo sin células. Se agregaron varias concentraciones (0,4, 1,6, 6,25, 25 y 100 mM) de los derivados seleccionados, así como sorafenib, a las células que luego se incubaron a 37 °C durante 48 h. Los cultivos se retiraron de la incubadora y se colocaron en una campana de flujo laminar u otra área de trabajo estéril donde cada vial de MTT [M-5655] se reconstituye para usarse con 3 ml de medio o solución salina equilibrada sin rojo de fenol ni suero. Agregar el MTT reconstituido en una cantidad igual al 10% del volumen del medio de cultivo. Después de un período de incubación de 2 a 4 h, según el tipo de célula y la densidad celular máxima; Los cristales de formazán producidos se disolvieron añadiendo una cantidad de solución de solubilización de MTT [M-8910] igual al volumen del medio de cultivo original. Medición de la intensidad del color producido mediante espectrofotómetro ROBONIK P2000 a una longitud de onda de 570 nm. Finalmente, se mide la absorbancia de fondo de las placas de varios pocillos a 690 nm y se resta de la medición de 570 nm. El porcentaje de viabilidad celular y la concentración del fármaco se utilizaron para construir la curva de supervivencia de HepG2 para cada uno de los compuestos probados. Los valores de CI50 (la concentración que provoca una inhibición del 50 % de la viabilidad celular) para los derivados seleccionados, así como para el compuesto farmacológico de referencia sorafenib, se obtuvieron en micromolar como el promedio de tres series independientes ± SE66,67.

Las actividades citotóxicas de los compuestos 10i y 10o se probaron frente a la línea celular normal Transformed Human Liver Epithelial-2 (THLE-2) (comprada en ATCC) utilizando Sorafenib como fármaco de referencia mediante el ensayo MTT para medir la viabilidad de las células68. Como se describió previamente; Se usaron placas de múltiples pocillos para tratar las células cultivadas con varias concentraciones de los derivados seleccionados y luego se incubaron durante 48 h a 37 °C. El formazán producido se midió mediante el espectrofotómetro ROBONIK P2000 a una longitud de onda de 570 nm. Los valores de concentración citotóxica (CC50) de los compuestos evaluados se informaron como la media de tres series independientes ± SE69.

El ensayo de apoptosis se realizó como se describió anteriormente70. Brevemente, el ensayo utilizó el kit de detección de apoptosis Anexina V-FITC (Abcam Inc., Cambridge Science Park, Cambridge, Reino Unido) junto con dos citometría de flujo de canales fluorescentes. El compuesto 10i, que tiene el valor de CI50 más bajo frente a las células HepG2, se aplicó a las células HepG2 a su concentración de CI50 y las células se dejaron incubar durante 48 h. Se recogieron aproximadamente 105 células mediante tripsinización y se lavaron dos veces consecutivas con PBS enfriado con hielo. Posteriormente, se añadió un volumen de 0,5 ml de solución de Anexina V-FITC/PI para teñir las células y se mantuvieron durante 30 minutos en un lugar oscuro a temperatura ambiente estándar. Luego, las células se trasladaron al citómetro de flujo Novocite ACEA (ACEA Biosciences Inc., San Diego, CA, EE. UU.), donde se seleccionaron los detectores FL2 y FL1 para la determinación de las señales PI y FITC. Se recomendó una consulta de 12.000 eventos para cada muestra. Se implementó el software ACEA NovoExpres (ACEA Biosciences Inc., San Diego, CA, EE. UU.) para el análisis de cuadrantes.

El ensayo se realizó como se mencionó anteriormente70. En resumen, las células HepG2 se preincubaron con el compuesto 10i a su concentración IC50 durante 48 h. Luego, se obtuvieron aproximadamente 105 células mediante tripsinización y se lavaron con solución salina tampón fosfato (PBS). A esto le siguió una etapa de resuspensión con etanol al 60% enfriado con hielo y una incubación hasta que se produjo la fijación. Las células fijadas se lavaron nuevamente y se resuspendieron en un tampón que incluía 50 µg/ml de ARNasa A y 10 µg/ml de yoduro de propidio. Finalmente, las células se incubaron a 37 °C en la oscuridad durante 20 minutos y se analizaron la cinética del ciclo celular utilizando citometría de flujo donde se usó FL2 (λex/em 535/617 nm) como detector de señal (citómetro de flujo ACEA Novocyt, ACEA Biosciences Inc. ., San Diego, California, EE.UU.). Se recomendó una consulta de 12.000 eventos para cada muestra. Para el análisis se utilizó el software ACEA NovoExpress (ACEA Biosciences Inc., San Diego, CA, EE. UU.).

El ARN total se aisló de sedimentos de líneas celulares HepG2 tratados con 10i y no tratados utilizando el kit Qiagen RNeasy Mini Cat# 74104 de acuerdo con las pautas del fabricante. Luego, la cuantificación y evaluación de la calidad de las muestras de ARN aisladas se determinaron mediante el espectrofotómetro Nanodrop en A230, A260 y A280.

La síntesis de ADNc se realizó para ARN utilizando el kit de transcriptasa inversa AMV de síntesis de ADNc de Promega (n.º de catálogo M5108) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los componentes de la reacción se agregaron como se muestra en la Tabla 9. La síntesis de ADNc se realizó en un ciclador térmico Bio-Rad 100.

Se diseñaron y sintetizaron cebadores para el gen VEGFR-2, seguido de la validación de los cebadores y la optimización de las condiciones de amplificación por PCR. Los cebadores utilizados se presentan en la Tabla 10. El análisis de expresión de RT-qPCR para los genes requeridos (β-actina y VEGFR-2) se realizó utilizando el kit de PCR Qiagen Quanti Nova SYBR Green (n.º de catálogo 208052). Los componentes de la reacción se demuestran claramente en la Tabla 11. La qPCR se realizó en un ciclador térmico de PCR en tiempo real Rotor-Gene Q -Qiagen.

Las células se recogieron y se lavaron con solución salina tampón fosfato (PBS). Luego, las células se lisaron en Tris-HCl 10 mM, NaCl 100 mM, Triton X-100 al 0,5%, pH 7,6 con un cóctel inhibidor de proteasa sin EDTA. A esto le siguió un paso de centrifugación a 13.000 g durante 20 minutos a 4 ° C y transferencia directa a gel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE). El análisis de transferencia Western se realizó utilizando anticuerpos primarios contra las proteínas diana y anticuerpos secundarios conjugados con HRP (Tabla 12). La reacción de quimioluminiscencia se realizó utilizando el sustrato HRP de transferencia Western ECL (Pierce, Thermo Fisher Scientific). Finalmente, la cuantificación densitométrica de las bandas de proteínas de Western blot se realizó con el software IMAGEJ.

Todos los cálculos de modelado molecular y estudios de acoplamiento se realizaron utilizando el software “Molecular Operating Environment” (MOE) versión 2019.01. El acoplamiento se realizó utilizando el método de colocación del triángulo alfa, las posturas se priorizaron según la puntuación de afinidad London dG y el refinamiento de los resultados se realizó utilizando el campo de fuerza. Preparación de la estructura cristalina descargada de la proteína objetivo disponible en Protein Data Bank, http://www.rcsb.org/pdb (PDB ID: 4ASD), comenzando con la eliminación de moléculas de agua seguida de la minimización de energía y la protonación 3D del amino. ácidos. La validación del proceso de acoplamiento se aseguró mediante el nuevo acoplamiento del ligando cocristalizado (Sorafenib) y se encontró que el RMSD obtenido era inferior a 1. Se informó que las interacciones de enlaces de hidrógeno formadas por sorafenib dentro del sitio activo de la proteína eran Glu 885, Cys 917 y Asp 1046. Se creó una base de datos que contiene los compuestos recién sintetizados para usar en el proceso de acoplamiento. Todos los compuestos se prepararon antes de los estudios de acoplamiento molecular mediante protonación 3D, adición de cargas parciales y minimización de energía. Se consideraron las medidas anteriores y se realizó el atraque.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado y sus archivos de información complementaria). Todos los conjuntos de datos están disponibles a través del autor correspondiente previa solicitud razonable.

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Financiamiento de acceso abierto proporcionado por la Autoridad de Financiamiento de Ciencia, Tecnología e Innovación (STDF) en cooperación con el Banco Egipcio de Conocimiento (EKB).

Los siguientes autores contribuyeron en partes iguales: Yassin M. Nissan, Reem K. Arafa y Sahar M. Abou-Seri.

Departamento de Química Farmacéutica, Facultad de Farmacia, Universidad de Ciencias y Artes Modernas de Octubre, El Cairo, 12451, Egipto

Zeinab S. El-Fakharany y Yassin M. Nissan

Departamento de Química Farmacéutica, Facultad de Farmacia, Universidad de El Cairo, Calle Kasr El-Aini, El Cairo, 11562, Egipto

Yassin M. Nissan y Sahar M. Abou-Seri

Departamento de Bioquímica, Facultad de Ciencias Médicas y de la Vida, Universidad de Hertfordshire Organizado por la Fundación Académica Global, Nueva Capital Administrativa, El Cairo, Egipto

Nada K. Sedky

Programa de Ciencias Biomédicas, Universidad de Ciencia y Tecnología, Ciudad de Ciencia y Tecnología de Zewail, Jardines de Octubre, Ciudad 6 de Octubre, Giza, 12578, Egipto

Reem K. Arafa

Laboratorio de Descubrimiento y Diseño de Fármacos, Ciudad de Ciencia y Tecnología de Zewail, El Cairo, 12578, Egipto

Reem K. Arafa

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SMA, RKA & YMN, concepción y diseño del proyecto de investigación, supervisión del avance del trabajo, interpretación de datos; ZSA, realizando la síntesis química y purificación, realizando el estudio in silico; NKS, realizando la evaluación biológica y la interpretación de sus datos; Todos los autores han contribuido a la redacción y revisión del manuscrito.

Correspondencia a Reem K. Arafa o Sahar M. Abou-Seri.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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El-Fakharany, ZS, Nissan, YM, Sedky, NK et al. Nuevos agentes quimioterapéuticos proapoptóticos basados ​​en la estructura de quinolona-3-carboxamida que actúan por inhibición de VEGFR-2. Representante científico 13, 11346 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-38264-w

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Recibido: 27 de abril de 2023

Aceptado: 05 de julio de 2023

Publicado: 13 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-38264-w

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