Desarrollando anti-cumarínicos multiobjetivo a base de

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 13370 (2023) Citar este artículo

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Se sintetizó y probó una nueva serie de andamios de cumarina 7-sustituidos que contienen un resto de éster metílico en la posición C4 y se probó su actividad antiproliferativa in vitro contra líneas celulares de cáncer de mama MCF-7 y MDA-MB-231 utilizando doxorrubicina (DOX). como referencia. Los compuestos 2 y 8 mostraron una selectividad notable contra MCF-7 con IC50 = 6,0 y 5,8 µM, respectivamente, en comparación con DOX con IC50 = 5,6 µM. Los compuestos 10, 12 y 14 exhibieron una selectividad considerable contra células negativas a estrógenos con IC50 = 2,3, 3,5 y 1,9 µM, respectivamente) en comparación con DOX con (IC50 = 7,3 µM). Los compuestos más prometedores se probaron como inhibidores del receptor del factor de crecimiento epidérmico y de las enzimas aromatasa (ARO) utilizando erlotinib y exemestano (EXM) como estándares, respectivamente. Los resultados demostraron que el compuesto 8 provocó la mayor actividad inhibidora (94,73 % de la potencia de EXM), mientras que los compuestos 10 y 12 mostraron el 97,67 % y el 81,92 % de la potencia de Erlotinib, respectivamente. Investigaciones adicionales mostraron que los candidatos prometedores 8, 10 y 12 provocaron la detención del ciclo celular en las fases G0-G1 y S e indujeron la apoptosis. La vía mecanicista se confirmó elevando las caspasas-9 y la relación Bax/Bcl-2. También se realizó una serie de métodos in silico que incluyen acoplamiento, detección ADMET de biodisponibilidad y estudio QSAR.

Una de las principales causas de mortalidad por cáncer en las mujeres es el cáncer de mama (CM), el segundo cáncer más común1. Aproximadamente el 75% de la CM es causada por el receptor de estrógeno (RE)2.

La inhibición de la biosíntesis de estrógenos es un enfoque eficaz para la terapia con BC hormonodependiente en mujeres posmenopáusicas3. La enzima aromatasa (ARO) es uno de los mecanismos enzimáticos que pueden regular el aumento de los niveles de estrógeno que se encuentran en las células BC. El exemestano (EXM) (Ia) se encuentra entre los potentes inhibidores de la aromatasa (IA)4.

Por otro lado, los receptores sobreexpresados ​​con mayor frecuencia en las células BC son los receptores de tirosina quinasa (TKR), por ejemplo, el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR)5. Por lo tanto, apuntar a esos receptores es una forma prometedora de desarrollar nuevos fármacos contra el cáncer. En este contexto, el primer inhibidor de EGFR reportado altamente expresado en diferentes formas de cáncer es Erlotinib (Ib)6,7.

Además, apuntar a diversas vías apoptóticas también es un enfoque eficaz para todos los tipos de cáncer8,9. Cualquier etapa de la vía puede ser objeto de tratamiento del cáncer10.

A la luz de la información anterior, es esencial desarrollar y sintetizar nuevos candidatos anticancerígenos con mayor selectividad. Las variadas características biológicas de los fármacos que contienen cumarina, especialmente la actividad anticancerígena, han generado mucho interés11,12,13. Las investigaciones sobre las propiedades biológicas de las cumarinas han descubierto que pueden atacar múltiples vías del cáncer, incluida la inhibición de la aromatasa, la inhibición de la quinasa, la detención del ciclo celular y la supresión de la angiogénesis14,15.

El estudio de las estructuras de EXM (Ia)16,17 y erlotinib (Ib)18 (Fig. 1a) ha proporcionado información estructural importante que nos ayudó en el diseño racional de nuevos inhibidores potentes de ARO/EGFR.

( a ) Principales características estructurales de EXM (Ia) y Erlotinib (Ib). (b) Cuadro de diseño con derivados de cumarina informados como un potente agente contra el cáncer de mama.

Es importante destacar que se seleccionaron varios candidatos anticancerígenos basados ​​en esqueletos de cumarina (II-VII) y sus características estructurales como el principal farmacóforo en el desarrollo de anti-BC multidireccional19,20,21,22,23. En este trabajo, el diseño molecular se basó principalmente en dos estrategias:

En la primera estrategia, basándonos en la evidencia anterior, hemos seleccionado EXM (Ia) y Erlotinib (Ib) como compuestos anti-BC líderes (Fig. 1a). En segundo lugar, optimización estructural de los compuestos principales mediante lo siguiente (Fig. 1b):

La estructura plana de cumarina (1,2-benzopirona) es un bioisóstero de la estructura de quinazolina en erlotinib y del núcleo de tetrahidronaftaleno-1,7-diona en EXM. Un esqueleto de este tipo será esencial para la actividad anticancerígena24,25.

El anillo de fenilo hidrófobo unido a la posición C4 del núcleo de cumarina mediante la introducción de un espaciador se consideraba anteriormente un farmacóforo biológicamente activo que se consideraba crucial para la actividad26,27,28,29.

La investigación SAR informada demostró que los conjugados que contienen grupos bencilo en la posición C7 exhibieron más actividad que sus análogos alquílicos. La introducción de grupos F o Cl en el anillo bencilo produjo una buena actividad19,23.

Los átomos giratorios del conector permiten que el grupo fenilo cierre la cavidad de entrada en el sitio de unión de la aromatasa30.

Con base en los hallazgos anteriores, trabajamos en la síntesis de derivados de cumarina 7-sustituidos con funcionalidad éster flexible en posición C4 para examinar su impacto en dos líneas celulares BC, las líneas celulares MCF-7 y MDA-MB-231, así como en células mamarias normales. MCF-10A. Los compuestos sintéticos se probaron in vitro para determinar su capacidad para inhibir las enzimas EGFR y ARO.

Los compuestos más potentes, como el examen del ciclo celular y los marcadores de apoptosis, se seleccionaron para realizar estudios adicionales con el fin de descubrir el proceso molecular detrás de su actividad anticancerígena.

Además, se llevaron a cabo estudios de modelización molecular para identificar los patrones de interacción de las dos enzimas e investigar la relación entre sus características fisicoquímicas y su acción inhibidora. Además, se realizó un análisis QSAR.

Los pasos de las Figs. 2 y 3 se utilizaron para sintetizar los intermedios y las moléculas diana. La 4-clorometil-7-hidroxicumarina (1)31 necesaria se sintetizó por primera vez mediante una reacción de ciclocondensación de Pechman que implica la condensación catalizada por ácido de resorcinol con 4-cloroacetoacetato de etilo en un procedimiento fácilmente escalable32,33.

Vías sintéticas de los nuevos derivados cumarínicos (7-12).

Síntesis de nuevos derivados de acetilcumarina (13-15).

Los derivados 2-4 de 7-hidroxicumarina se obtuvieron mediante la reacción de sustitución nucleofílica del compuesto 1 con ion carboxilato que contiene ion Na como contracatión en DMF (Fig. 2). Las estructuras de los nuevos derivados intermedios 2 a 4 se confirmaron utilizando datos espectrales. El espectro de RMN 1H mostró la aparición de protones OH intercambiables a 10,69–10,72 ppm y protones CH2 a 5,50–5,60 ppm. Además, la RMN 13C mostró señales en 165,6–166,9 asignadas al C = O del grupo carboxilato. Todos los carbonos aromáticos aparecieron en la región esperada. Además, el espectro IR mostró una banda ancha característica entre 3100 y 3200 cm-1 correspondiente al grupo OH y una absorción típica del grupo carbonilo entre 1690 y 1720 cm-1 correspondiente a dos grupos carbonilo.

Los intermedios 5 y 6 se sintetizaron mediante benzoilación del grupo fenólico 7-OH en 1 con el bromuro de fenacilo apropiado en presencia de acetona y K2CO3. La confirmación de las estructuras mediante datos espectrales reveló la aparición de una señal de RMN 1H singlete en δ 5,77–5,79 característica del –OCH2– recién formado y la aparición de una nueva señal de RMN 13C del grupo C = O en δ 193,3–194,8.

Los nuevos derivados de cumarina Target 7–12 se obtuvieron de 1 a través de dos vías: sustitución nucleofílica de 1 y benzoilación de 2–4 (vía A, Fig. 2)34,35. El orden de estos dos pasos se puede invertir para producir los mismos derivados de cumarina objetivo 7-12 (vía B, figura 2). Se observó que la vía B era menos favorable que la A en relación con el rendimiento y la pureza de los productos. Esto puede deberse a una alquilación competitiva en el grupo metileno ácido en la posición-4. El grupo benzoato voluminoso obstaculizará estéricamente esta reacción secundaria más que el grupo cloruro, lo que coincide con la literatura31. Los rendimientos informados (45–77%) y las características de los compuestos 7–12 se basaron en la vía A. Vale la pena informar que se intentó la reacción en un solo recipiente, pero desafortunadamente, el rendimiento y la pureza de los productos fueron deficientes (Ruta C, Figura 2).

Las estructuras de 7-12 fueron confirmadas por datos espectrales en los que el protón intercambiable OH desapareció en su RMN 1H. Una señal singlete de protones COCH2 apareció a δ 5,78–5,81 ppm, y otra señal singlete para CH2Cl apareció en el campo a δ 5,60–5,64 ppm. Los protones aromáticos se encontraron en la región y el patrón esperados. Además, los espectros de RMN de 13C revelaron la presencia de tres grupos carbonilo en los rangos de 196,4–193,3, 165,6–164,8 y 162,9–161,6, correspondientes a benzoilo C=O, benzoato C=O y cumarina C=O; respectivamente.

Como se muestra en la Fig. 3, la reacción de acetilación se llevó a cabo con una mezcla de anhídrido acético y ácido acético para producir cumarinas O-acetiladas (13-15)36. La presencia del grupo acetilo se confirmó mediante un pico singulete a 2,33–2,34 ppm correspondiente a COCH3 en 1H RMN y una señal de C=O a 169,2–169,3 en 13C NMR. Además, la señal singlete de OCH2 en el espectro de RMN 1H se encontró entre 5,62 y 5,67 ppm. Los protones aromáticos se encontraron en sus regiones aromáticas esperadas. Los espectros de RMN de 13C demostraron la presencia de tres grupos carbonilo en los rangos de 169,2–169,4, 165,4–165,6 y 158,9–159,8 correspondientes a acetilo C = O, benzoato C = O y cumarina C = O, respectivamente. Todos los pasos de síntesis química se consideraron adecuados y concisos con rendimientos apropiados.

Para la línea celular MCF-7, los resultados mostrados en la Tabla 1 revelaron que los compuestos más potentes fueron los derivados de benzoato de metilo 2 y 8 con IC50 = 6,0 µM y 5,8 µM, respectivamente, en comparación con IC50 = 5,6 µM para el fármaco estándar DOX.

Para MDA-MB-231, la acción más prometedora se informó para los compuestos 4, 5, derivados de benzoato de metilo 10, 12 y compuesto 14 con valores de IC50 de 6,4, 5,8, 2,3, 3,5 y 1,9 µM, respectivamente, en comparación con el fármaco estándar DOX que tenía un valor de IC50 de 7,3 µM.

El compuesto de partida 1 carecía de actividad contra ambos tipos de líneas celulares.

Se observó que la introducción del sustituyente benzoato en la posición 4 en la estructura de cumarina potenciaba la actividad. Esto posiblemente se explica por interacciones hidrófobas específicas del grupo fenilo.

Evidentemente, el compuesto que lleva el benzoato 2 no sustituido exhibió una selectividad superior contra MCF-7 que contra MDA-MB-231 con IC50 = 6 µM frente a IC50 = 51,9 µM, respectivamente, en comparación con el fármaco de referencia.

La incorporación del grupo aceptor de electrones en la posición 4 del resto aromático en el compuesto 3 mostró una selectividad moderada hacia MCF-7 que hacia MDA-MB-231. Por el contrario, la sustitución de un grupo metoxi donador de electrones en la posición 2 como en el compuesto 4 dio como resultado una selectividad beneficiosa contra MDA-MB-231 que las líneas celulares MCF-7 con valores IC50 = 6,4 y 17,2 µM, respectivamente.

La actividad de la serie cumarina de 7-(2-oxo-2-feniletoxi)-4-metilbenzoato (7-12) varió según el tipo de sustituyentes en comparación con los intermedios 2-4. La incorporación de 2-oxo-2-feniletoxi en la posición 7 del resto cumarina en los compuestos 7, 9 y 11 disminuyó la actividad contra la línea celular MCF-7, al tiempo que resultó en una actividad antiproliferativa deficiente contra la célula MDA-MB-231. línea. El compuesto 9 que lleva un átomo de halógeno en la posición p se identificó como el candidato citotóxico más importante entre las series que revelan una potente selectividad contra la línea celular MDA-MB-231 con un valor de CI50 de 10,4 µM.

En general, la monosustitución con un grupo aceptor de electrones en el resto fenilo, como el átomo de p-cloro ubicado en C7- del anillo de cumarina en los compuestos 8, 10, 12 y 14, mejoró dramáticamente la actividad contra ambas líneas celulares, en comparación con las no sustituidas. derivados. En este contexto, se podría destacar que el compuesto objetivo 8 mostró una alta selectividad contra MCF-7 que MDA-MB-231 (IC50 = 5,8 µM versus IC50 = 27,5 µM), mientras que los compuestos 10, 12 y 14 mostraron una selectividad superior contra MDA. -MB-231 con IC50 = 2,3, 3,5 y 1,9 µM, respectivamente. Afortunadamente, el compuesto 12 fue el más potente de esta serie contra MCF-7 y MDA-MB-231 con IC50 = 13,2 µM y 3,5 µM, respectivamente.

Sorprendentemente, el compuesto 6 con un átomo de cloro aceptor de electrones mostró un nivel de actividad más bajo contra ambas líneas celulares, lo que se suponía que implicaba enlaces H con aminoácidos en el dominio de unión al ligando.

Con respecto a las cumarinas 13-15 que llevan el grupo 7-acetiloxi, el derivado 14 mostró una selectividad superior contra MDA-MB-231 que MCF-7 en 150 veces con (IC50 = 1,9 µM). Por el contrario, el compuesto 15 mostró una actividad antiproliferativa moderada contra MCF-7 (IC50 = 17,1 µM).

Los compuestos también se examinaron frente a las células humanas no malignas MCF10A (mama) para investigar su selectividad entre células no malignas y células cancerosas. En comparación con DOX (IC50 = 12,4 µM), los compuestos más activos 8, 10, 12 y 14 fueron menos tóxicos para las células MCF10A (IC50 = 79,9, 76,8, 72,1 y 263,1 µM, respectivamente) con buenos valores de SI (más de 10). (Tabla 1).

Los compuestos más activos se sometieron adicionalmente a inhibición enzimática in vitro mediante un ensayo enzimático ELISA.

Ensayo de inhibición de la enzima EGFR.

Las líneas celulares MDA-MB-231 podrían expresar principalmente la enzima EGFR, mientras que las líneas celulares MCF-7 solo produjeron la enzima aromatasa23. Así, se realizó un estudio de ensayo enzimático para las enzimas ARO y EGFR en líneas celulares MCF-7 y MDA-MB-231, respectivamente.

Se observó que los compuestos 10 y 12 mostraron el mayor efecto de inhibición hacia EGFR, mostrando 97,67 % y 81,92 % de la potencia de erlotinib, respectivamente (Tabla 2, Figura complementaria S1). Por lo tanto, su potente selectividad contra MDA-MB-231 podría deberse a la vía de inhibición de EFGR.

(ARO) ensayo de inhibición enzimática

Para convertir andrógenos en estrógenos, se demostró que la línea celular MCF-7 posee suficiente actividad de la enzima aromatasa37. Los resultados se presentan en la Tabla 3, Figura complementaria S2, y revelaron que el compuesto objetivo 8 se considera el IA más potente (valor IC50 = 0,114 µM), en comparación con EXM (valor IC50 = 0,108 µM), y esto describe el valor elevado. de IC50 en MCF-7 (5,8 µM). Además, el compuesto diana 2 exhibió la mitad de actividad inhibidora de ARO que la del EXM de referencia.

Los resultados se presentan en la Tabla 4, Figura complementaria S3. Con respecto a la línea celular MCF-7, el porcentaje de células apoptóticas aumentó significativamente en la fase pre-G1 en 18,67 veces con una detención significativa en las fases G0-G1 y S en 1,508 y 1,33 veces, respectivamente, en comparación con las células de control no tratadas para el compuesto. 8. Para las líneas celulares MDA-MB-231, cuando se trataron con los compuestos 10, 12 y 14, el porcentaje de células apoptóticas en la fase pre-G1 aumentó 16,22, 22,46 y 19,9 veces con la consiguiente detención del ciclo celular en la fase S por 1,59, 1,08 y 1,38 pliegues, respectivamente. Los resultados indicaron que el compuesto 8 probado contra la línea celular MCF-7 y los compuestos 10, 12 y 14 probados contra la línea celular MDA-MB-231 mostraron apoptosis pre-G1 y detención del ciclo celular en la fase S además de G0-G1 por compuesto 8.

Para asegurar aún más la capacidad apoptótica de los compuestos 8, 10, 12 y 14 usando tinción dual con yoduro de propidio (PI) y anexina-V-FITC, se llevó a cabo un análisis de citometría de flujo para distinguir entre células vivas, apoptóticas tempranas, tardías y necróticas. . El yoduro de propidio tiñe el ADN de las células apoptóticas y necróticas tardías, mientras que la anexina V se une poderosa y distintivamente a la fosfatidilserina (PS) en sus superficies y emite una fluorescencia verde38. Los resultados del ensayo se proporcionan en la Tabla 5 y (Figuras complementarias S4 y S5) como clasificador de células activadas por fluorescencia (FACS) y perfiles de citometría con PI en el eje Y y anexina V-FITC en el eje X. Además, el cuadrante de cada perfil tiene cuatro secciones: necrosis, apoptosis temprana y tardía y células vivas, en el sentido de las agujas del reloj desde la parte superior izquierda. Los resultados se demuestran en la Tabla 5, lo que indica que el compuesto 8 mostró un % de apoptosis de 31,19 para las células MCF-7, mientras que se encontró que el % de apoptosis para las células MDA-MB-231 de los compuestos 10, 12 y 14 era 33,43, 46,28 y 41,02, respectivamente; en comparación con 1,67 y 2,06 para MCF-7 y MDA-MB-231 no tratados de control.

La apoptosis se provoca en una célula a través de dos vías apoptóticas principales, la vía extrínseca y la intrínseca. Al sobreexpresar proteínas antiapoptóticas como Bcl-2 o regular negativamente proteínas proapoptóticas como Bax a través de la vía apoptótica intrínseca, las células cancerosas pueden desarrollar resistencia apoptótica39. En este estudio, medimos los niveles de Bax y Bcl2 para evaluar los efectos de los compuestos 8, 10, 12 y 14, que mostraron una actividad inductora de apoptosis prometedora en la vía apoptótica intrínseca. Como se muestra en (Tabla complementaria S6 y Fig. Suplementaria S7), los compuestos probados 8, 10, 12 y 14 aumentaron significativamente la expresión de la proteína proapoptótica Bax en 5,27, 5,27, 5,22 y 4,9 veces, respectivamente, con la consiguiente disminución de los niveles de proteína antiapoptótica Bcl-2 en 0,44, 0,377, 0,271 y 0,329 veces, respectivamente, en comparación con el control. Como resultado, se observó un aumento significativo en la proporción Bax/Bcl-2, lo que respalda la afirmación de que los compuestos probados pueden mejorar la respuesta terapéutica en el cáncer de mama.

La caspasa-9, activada en células apoptóticas por vías intrínsecas, puede usarse como marcador para la inducción de apoptosis por agentes anticancerígenos.40. En el presente estudio, se midieron los niveles de caspasa-9 en los compuestos que mostraban un aumento notable en la proporción Bax/Bcl-2 para identificar una posible vía para la actividad antiproliferativa de los compuestos más prometedores. Se observaron niveles significativamente elevados del nivel de proteína caspasa-9 en las muestras tratadas (Tabla complementaria S8 y Fig. Suplementaria S9) en 6,71 veces para el compuesto 8, mientras que los compuestos 10, 12 y 14 dieron como resultado 6,42, 7,33 y 4,37 veces. elevación, respectivamente, en comparación con las células de control. Estos resultados sugirieron que todos los compuestos probados podrían inducir una sobreexpresión significativa en el nivel de proteína caspasa-9 superior a la provocada por el control, asumiendo que la apoptosis probablemente se debió a la activación de la proteína caspasa-9.

El análisis de los datos se realizó mediante el software SPSS, versión 25 (SPSS Inc., PASW Statistics para Windows versión 25. Chicago: SPSS Inc.). La apoptosis se describió mediante números y porcentajes. Los datos cuantitativos se describieron utilizando la media ± desviación estándar para datos distribuidos normalmente después de probar la normalidad mediante la prueba de Shapiro Wilk. La significancia de los resultados obtenidos se juzgó en el nivel (≤ 0,05). Se utilizaron pruebas de Chi-Cuadrado y Z para comparar datos cualitativos entre grupos, según correspondiera. Se utilizó la prueba ANOVA unidireccional para comparar más de 2 grupos independientes con la prueba Post Hoc Tukey para detectar la comparación por pares.

Los resultados del nuevo acoplamiento del ligando cocristalizado (Erlotinib) y su modo de unión se describieron en la (Tabla 6, Figuras complementarias S10 y S11).

Los resultados del acoplamiento mostraron que los compuestos 10 y 12 exhibieron buenas interacciones de unión y puntuaciones de acoplamiento similares a Erlotinib (Tabla 6). Se sugiere que la planaridad del resto quinazolina en erlotinib parece importante para estabilizar el sitio de unión de EGFR. De manera similar, la naturaleza plana de la estructura de cumarina en los compuestos 10 y 12 les permitió integrarse en el sitio activo de EGFR, como se muestra en sus interacciones 2D (Figura complementaria S12) y modos de unión 3D como en la Figura 5. descubrieron que el grupo C=O del esqueleto de cumarina se superponía con el átomo N1 de la fracción quinazolina de erlotinib, que de manera equivalente servía para anclar con Met 769, que se consideraba la interacción clave que mejoraba la estabilización. Al investigar el sitio de unión del receptor, se observó la presencia de un resto o-metoxi o p-clorofenilo en la posición 4-carboxilato de metilo del núcleo de cumarina en los compuestos 10 y 12, respectivamente, ubicados en el bolsillo hidrofóbico, que incluía cadenas laterales Leu 764, Leu 753, Met 742, Ile 720 e Ile 765 en cuanto al grupo etinil-fenilo en erlotinib42 (Figura complementaria S13).

Además, se mostraron interacciones de enlaces de halógeno adicionales con el aminoácido His 781 con el átomo de cloruro en C4 de la cadena lateral de feniloxi en C7 del núcleo de cumarina con longitud de enlace (2,22 Å para el compuesto 10 y 2,32 Å para el compuesto 12). Esta interacción parece ayudar a su inmovilización; de la misma manera, la cadena lateral de éter en erlotinib como se ilustra en (Fig. 4).

(a) Modo de unión del compuesto 10 (azul) y erlotinib (verde), (b) Modo de unión del compuesto 12 (azul) y erlotinib (verde), (c) Modo de unión del compuesto 10 (rojo), compuesto 12 (verde ) y erlotinib (azul) ocupando el sitio activo. Los 2 compuestos tenían el mismo modo de unión que el ligando nativo. Se unieron al residuo clave Met 769. La presencia del átomo de p-cloro mejoró su estabilidad. La cadena lateral hidrófoba de ambos compuestos cambió su orientación para incrustarse en una bolsa hidrófoba. La fracción cumarina fue enterrada en la bolsa en paralelo al núcleo de quinazolina en erlotinib.

Para racionalizar los resultados biológicos, se creía que la escasa acción inhibidora del EGFR de los compuestos 11 y 14 estaba relacionada con su incapacidad para unirse con el aminoácido esencial y su baja puntuación de acoplamiento de -5,7394 y -5,4982 kcal/mol, respectivamente. (Figura complementaria S14). Por lo tanto, los datos adquiridos revelaron que los modos de unión de los compuestos investigados eran consistentes con su acción inhibidora de EGFR.

Por otro lado, a pesar de que el compuesto 8 muestra las mismas características de unión que los inhibidores de EGFR 10 y 12 más potentes en el sitio activo con una puntuación de acoplamiento de -6,7717 kcal/mol y RMSD = 1,9314 Å, inesperadamente poseía una actividad inhibidora de EGFR débil. Sin embargo, se podría afirmar que pueden estar involucrados otros factores que afectan la actividad relacionados con la lipofilicidad y la solubilidad.

Los resultados de los ligandos reacoplados (ASD y EXM) se resumen en la (Tabla 6) y sus modos de unión se describen en la (Figura complementaria S15). Las enzimas aromatasa comprenden un grupo protésico hemo que contiene hierro en el centro de reacción activo43.

Con respecto al compuesto 8, el AI más potente mostró un modo de unión aceptable (Tabla 6, Fig. 5). En comparación con el modo de unión de los ligandos, se descubrió que la estructura de cumarina se estabilizó mediante la interacción areno-areno con el anillo de 5 miembros del resto hemo, que se considera la interacción impulsora de la unión.

Modos de unión 3D de los compuestos 2 y 8 dentro del bolsillo de unión de ARO (PDB ID: 3EQM) y los compuestos 10 y 12 en el sitio activo de EGFR (PDB ID: 1 M17).

El benzoato no sustituido en la posición 4 de la cumarina es esencial para la actividad, ya que se une a Met 374 mediante un enlace H (2,84 Å) y proporciona una asignación conveniente en la bolsa hidrófoba, constituida por los residuos Val 373, Met 374, Leu 372, Ile 398.

La introducción de un sustituyente en el resto fenilo (p-cloro u o-metoxi) dio como resultado una disminución drástica de la actividad debido a un efecto estérico o a un cambio en la lipofilicidad.

En particular, la distancia entre el anillo de benceno colocado en la bolsa hidrófoba y el resto de cumarina es probablemente la misma que la longitud total de ASD (6,97 Å, 6,69 Å, respectivamente) y desempeña un papel importante en el control de la afinidad. La sustitución en la posición 4 del puente de metileno podría ser la responsable de la actividad.

Además, la cadena lateral de fenil etoxi en la posición 7 se giró ligeramente para incrustarse en el sitio de unión y pareció inducir un enlace H débil adicional con Thr 310 (3,64 Å) para cerrar la cavidad de entrada entre Asp 309 y Ser 47820. Por más tiempo, el sustituyente en la posición 7 podría justificar una mejor afinidad por el sitio de unión que el resto OH libre. Estas tres interacciones del sitio de unión se cumplieron cuando el anillo de cumarina llevaba un grupo metilo carboxilato de bencilo en la posición 4 y un sustituyente p-clorofenil etoxi en la posición 7. Por lo tanto, se puede explicar el mejor modo de unión del compuesto objetivo 8 en comparación con el compuesto 2, en el que mostró la misma manera de unión con el grupo amida principal de Met 374 (3,42 Å) y el resto hemo a través de la interacción areno-H. Sin embargo, el grupo hidroxilo libre en la posición 7 mostró una disminución en la actividad debido a la incapacidad de cerrar el lado de entrada de la bolsa (Fig. 5). Las posturas de unión 2D de ambos compuestos se muestran en la (Figura complementaria S16).

Por otro lado, debido a la correlación entre el volumen del sustituyente de la posición 4 y la actividad, se puede suponer que el sustituyente o-metoxi en el compuesto 11 (CI50 = 5,98 µM) generó impedimento estérico en la parte posterior del modo de bolsillo y de unión inestable con puntuación (S) = − 0,1435 kcal/mol. Además, el compuesto 6 (IC50 = 3,93 µM) no ilustra la hipótesis de unión de tres sitios ya que su volumen molecular es menor que el sitio de bolsillo. Ambos compartieron la falta de interacción esencial en la parte trasera o en la entrada y valores inaceptables de RMSD de más de 2 (Figura complementaria S17).

Para comprender el comportamiento farmacocinético de los compuestos más activos 8, 10, 12 y 14, se calcularon sus caracteres fisicoquímicos con la ayuda de la aplicación en línea del servidor ADMETSAR http://lmmd.ecust.edu.cn/admetsar1 aplicando varios ADMET cualitativos. modelos como se describe en la (Tabla 7). Los resultados revelaron que todos los compuestos poseían una buena absorción intestinal y podían atravesar la barrera hematoencefálica. Además, los compuestos candidatos mostraron una buena biodisponibilidad oral, lo que los convierte en candidatos prometedores como agentes anti-BC.

El análisis QSAR se llevó a cabo en los compuestos sintetizados contra células cancerosas MDA-MB-231, donde la mayoría de los compuestos mostraron una buena selectividad utilizando el software MOE. Los compuestos sintetizados se utilizaron como conjunto de entrenamiento con su pIC50 experimental (-log IC50). Se calcularon diversos descriptores fisicoquímicos.

Los descriptores Vsurf explicaron las interacciones hidrofílicas e hidrofóbicas, mientras que los enlaces hidrofóbicos fueron descritos por los descriptores vsurf_D (vsurf_D5 y vsurf_D3)44,45.

La siguiente ecuación representa el mejor modelo QSAR: pIC50 = 7,49008 + 0,41537 log P (o/w)—0,01752 E_vdw + 0,26664 opr_nrot—0,02428 vsurf_D3—0,00142 Peso + 0,01549 vsurf_D5—0,26814 logS (con raíz del error cuadrático medio ( RMSE) = 0,39205 y coeficiente de correlación al cuadrado (r2) = 0,21403. Según la ecuación anterior, la actividad anticancerígena se vio potenciada por log P (lipofilicidad), vsurf D5 (uniones hidrofóbicas) y Opr nrot (número de enlaces giratorios), mientras que la actividad es correlacionado negativamente con lo siguiente: energía de van der Waal, interacciones polares, peso molecular y log S (solubilidad acuosa).

La confiabilidad del modelo construido fue confirmada por una excelente linealidad [$PRED = 0.2094 (pIC50) + 4.215], con R2 = 0.326 (Fig. 6) y los valores relativos entre las actividades predichas y experimentales (Tabla 8). Se descubrió que los valores predichos son cercanos a los investigados experimentalmente, lo que indica que el modelo QSAR es confiable y puede aplicarse de manera segura para predecir compuestos más efectivos.

pCI50 experimental versus predicha de los compuestos probados contra la línea celular de cáncer humano MCF-7.

En el estudio actual, se diseñó una nueva serie de derivados no esteroideos de cumarina 4,7-disustituida (1,2-benzopirona) que llevan un resto éster metílico en la posición C4 como agentes anti-BC. Se adoptaron vías sintéticas sencillas y de buen rendimiento para preparar los compuestos diseñados. Se utilizó el método de ensayo MTT para evaluar su actividad anti-BC in vitro contra las líneas celulares MCF-7, MDA-MB-231 y MCF-10A utilizando doxorrubicina (DOX) como fármaco de referencia. En general, la mayoría de los compuestos probados revelaron una selectividad por MDA-MB-231 mayor que por MCF-7. En particular, los compuestos 2 y 8 mostraron una selectividad obvia contra MCF-7, mientras que los compuestos 4, 5, 10, 12 y 14 exhibieron una selectividad considerable contra la línea celular MDA-MB-231.

En conclusión, se podría enfatizar que "la monosustitución con grupos aceptores de electrones como cloro en una fracción fenilo es crucial para la actividad anti-BC contra ambas líneas celulares, ya que podría estar involucrada en interacciones electrostáticas.

La actividad citotóxica de los compuestos 10 y 12 contra MDA-MB-231 podría deberse a su potente actividad inhibidora de EGFR, mientras que el compuesto 8 contra MCF-7 podría atribuirse a su actividad inhibidora de ARO. Con respecto al compuesto 14, poseía una débil actividad inhibidora del EGFR a pesar de su potente actividad anticancerígena en las líneas celulares MDA-MB-231. En consecuencia, se realizaron más investigaciones para los compuestos más activos 8, 10, 12 y 14 para descubrir vías más mecanicistas para su actividad antiproliferativa, como el análisis del ciclo celular y el ensayo de apoptosis mediante citometría de flujo. Se descubrió que podían inducir la detención del ciclo celular en las fases G0-G1 y S. Su mecanismo apoptótico quedó demostrado por un aumento significativo tanto en la relación Bax/Bcl-2 como en la caspasa-9. Las actividades inhibidoras de los compuestos 2 y 8 sobre las enzimas ARO y 10 y 12 sobre EGFR se confirmaron mediante estudios de acoplamiento, destacando interacciones de unión significativas. También se llevó a cabo el estudio ADMET para describir mejor la farmacocinética de los fármacos sintetizados. Los hallazgos del modelo QSAR revelaron que debería haber un equilibrio entre los sustituyentes hidrófilos e hidrófobos de los compuestos, lo que fue confirmado por los resultados del acoplamiento. Por lo tanto, los resultados observados mostraron que estos compuestos eran susceptibles de modificarse aún más para servir como agentes anti-BC multidireccionales prometedores (Figura complementaria S18).

Los puntos de fusión se determinaron en un aparato de punto de fusión Stuart y no están corregidos. Los microanálisis se realizaron en la Universidad de El Cairo y se realizaron en un analizador elemental Perkin-Elmer 240 para elementos C, H y N, y los resultados estuvieron dentro del rango aceptable de los valores teóricos. Las RMN de 1H y 13C se realizaron en la Universidad de Mansoura y se registraron en un espectrómetro Brucker de 400 MHz y un espectrómetro de 100 MHz, respectivamente. Los cambios químicos se expresan en δ ppm con referencia a TMS. Utilizando un espectrómetro infrarrojo Nicolet iS10, se registraron los espectros IR en la Universidad Mansoura. Los análisis espectrales de masas se realizaron en Thermo SCIENTIFIC DCQII en la Universidad de Azhar. Todos los productos químicos y reactivos utilizados se adquirieron en Aldrich Chemicals Co, EE. UU.

A una solución de 1 (0,45 g, 2 mmol) en DMF (8 ml), se añadió la sal sódica apropiada del ácido benzoico (no) sustituido (2 mmol). La mezcla de reacción se calentó a 90ºC durante la noche, después se enfrió y se vertió sobre agua con hielo. Los productos sólidos separados se filtraron, se secaron y luego se recristalizaron en EtOAc/MeOH (4:1).

Blanco sólido; Rendimiento 72%; Pf 248-250 °C. IR (KBr) υmáx (cm-1): 3154 (OH); 2943 y 2840 (CH alifático); 1720 y 1689 (C=O); 1614 y 1568 (C=C); 1136 (C – O – C). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): δ 10,72 (s, 1H, OH, D2O intercambiable), 8,08 (d, 2H, J = 7,5 Hz, fenil-C2-H y C6-H), 7,73 (t, J = 7,2 Hz, 1H, Fenil-C4-H), 7,68 (d, J = 8,6 Hz, 1H, C5-H), 7,59 (t, 2H, J = 7,6 Hz, Fenil-C3-H y C5-H ), 6,85 (dd, 1H, J1 = 8,6, J2 = 1,5 Hz, C6-H), 6,79 (d, 1H, J = 1,5 Hz, C8-H), 6,29 (s, 1H, C3-H), 5,60 (s, 2H, OCH2). RMN 13C (100 Hz, DMSO-d6), δ (ppm): δ 165,6 (C=O), 162,0 (C2=O), 160,6 (C7), 155,6 (C4), 150,9 (C8a), 134,3 (Fenil- C4), 130,0 (dos Fenil-C2 y C6), 129,5 (dos Fenil-C3 y -C5), 129,4 (Fenil-C1), 126,6 (C5), 113,7 (C6), 110,0 (C4a), 108,8 (C3) , 103,0 (C8), 62,5 (CH2). MS (m/z%): 296,22 (1,39, M+), 294,85 (M-H+), 105,18 (100). Análisis elemental para C17H12O5, calculado: C, 68,92; H, 4,08; Encontrado: C, 68,78; H, 4,26.

Blanco sólido; Rendimiento 80%; Pf 173-175 °C. IR (KBr) υmáx (cm-1): 3174 (OH); 2930 y 2846 (CH alifático); 1721 y 1690 (C=O); 1599 (C=C); 1130 (C – O – C). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): δ 10,69 (s, 1H, OH, D2O intercambiable), 7,95 (d, 2H, J = 8,3 Hz, fenil-C2-H y C6-H), 7,58 (d, 2H, J = 8,3 Hz, Fenil-C3-H y C5-H), 7,69 (d, 1H, J = 8,7 Hz, C5-H), 6,86 (dd, 1H, J1 = 8,7, J2 = 1,3 Hz, C6 -H), 6,77 (d, 1H, J = 1,3 Hz, C8-H), 6,43 (s, 1H, C3–H), 5,50 (s, 2H, OCH2). RMN 13C (100 Hz, DMSO-d6), δ (ppm) 166,9 (C=O), 161,7 (C2=O), 160,8 (C7), 155,7 (C4), 151,5 (C8a), 138,4 (Fenil-C4) , 131,6 (Fenil-C2), 131,6 (Fenil-C6), 129,9 (Fenil-C1), 129,3 (dos fenil-C3 y C5), 127,1 (C5), 113,6 (C6), 111,5 (C4a), 109,9 (C3 ), 102,9 (C8), 62,5 (CH2). MS (m/z%): 332,03 (22,66, M+2), 330,50 (24,62, M+), 252,22 (100). Análisis elemental para C17H11ClO5, calculado: C, 61,74; H, 3,35; Encontrado: C, 61,97; H, 3,51.

Blanco sólido; Rendimiento 64%; Pf 268-270 °C. IR (KBr) υmáx (cm-1): 3260 (OH); 3097 (CH aromático), 2999, 2941 y 2836 (CH alifático); 1721 y 1693 (C=O); 1612 y 1567 (C=C); 1130 (C – O – C). RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): δ 10,69 (s, 1H, C7–OH, D2O intercambiable), 7,77 (d, 1H, J = 7,5 Hz, fenil-C6-H), 7,69 (d, 1H J = 8,7 Hz, C5–H), 7,62 (t, 1H, J = 7,9 Hz, Fenil-C4-H), 7,22 (d, 1H, J = 8,4 Hz, Fenil-C3-H), 7,08 (t, 1H , J = 7,5 Hz, Fenil-C5-H), 6,85 (dd, 1H, J1 = 8,7, J2 = 1,6 Hz, C6-H), 6,78 (d, 1H, J = 1,6 Hz, C8-H), 6,37 (s, 1H, C3-H), 5,55 (s, 2H, OCH2), 3,88 (s, 3H, CH3). RMN 13C (100 Hz, DMSO-d6), δ (ppm) δ 165,6 (C=O), 162,7 (C2=O), 161,8 (C7), 160,6 (Fenil-C2), 158,8 (C4), 155,5 (C8a ), 151,1 (Fenil-C4), 134,7 (Fenil-C6), 131,6 (C5), 126,5 (Fenil-C1), 120,7 (Fenil-C5), 119,3 (C6), 113,5 ((Fenil-C3), 113,1 ( C4a), 109,6 (C3), 108,6 (C8), 62,3 (CH2), 56,2 (OCH3). MS (m/z %): 326,24 (4,06, M+), 325,61 (10,6, M-H+), 44,22 (100 ) Análisis elemental para C18H14O6, calculado: C, 66,26; H, 4,32; Encontrado: C, 66,45; H, 4,59.

A una solución de 1 (0,32 g, 1,5 mmol) en acetona (10 ml), se le añadió K2CO3 anhidro (0,29 g, 3 mmol) y el bromuro de fenacilo apropiado (1,5 mmol). La mezcla de reacción se mantuvo en agitación a temperatura ambiente durante aproximadamente 4 h y se controló mediante TLC (éter de petróleo/acetato de etilo, 7:3 v/v). Después de la filtración, la solución se concentró al vacío. El residuo obtenido se recristalizó en una mezcla de EtOAc/acetona (4:1).

Blanco sólido; Rendimiento 63%; Pf 180-182 °C. RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): δ 8,06 (d, 2H, J = 7,2 Hz, fenil-C2-H y C6-H), 7,79 (d, 1H, J = 8,9 Hz, C5-H), 7,73 (t, 1H, J = 7,4 Hz, Fenil-C4-H), 7,60 (t, 2H, J = 7,6 Hz, Fenil-C3-H y C5-H), 7,16 (d, 1H, J = 2,5 Hz , C8-H), 7,10 (dd, 1H, J1 = 8,9, J2 = 2,5 Hz, C6-H), 6,52 (s, 1H, C3-H), 5,79 (s, 2H, OCH2), 5,02 (s, 2H, CH2Cl). RMN 13C (100 Hz, DMSO-d6), δ (ppm) 194,8 (C=O), 161,8 (C2=O), 160,4 (C7), 155,5(C8a), 151,2 (C4), 134,6 (Fenil-C4) , 134,4 (Fenil-C1), 129,3 (dos Fenil-C2 y-C6), 128,3 (dos Fenil-C3 y -C5), 126,8 (C5), 113,2 (C6), 112,6 (C3), 111,2 (C4a), 102,45 (C8), 71,07 (CH2), 41,8 (CH2). EM (m/z %): 328,88 (19,45, M+), 330,20 (15,51, M++ 2), 329,80 (10,36, M+ + 1), 125,26 (100). Análisis elemental para C18H13ClO4, calculado: C, 65,76; H, 3,99; Encontrado: C, 66,02; H, 4,13.

Sólido pulido; Rendimiento 66%; Pf 195-197 °C. RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): δ 8,07 (d, 2H, J = 8,4 Hz, fenil-C2-H y C6–H), 7,79 (d, 1H, J = 8,8 Hz, C5–H), 7,69 (d, 2H, J = 8,4 Hz, fenil-C3-H y C5-H), 7,17 (d, 1H, J = 2,2 Hz, C8–H), 7,11 (dd, 1H, J1 = 8,8 Hz, J2 = 2,2 Hz, C6-H), 6,53 (s, 1H, C3-H), 5,77 (s, 2H, OCH2), 5,02 (s, 2H, CH2Cl). RMN 13C (100 Hz, DMSO-d6): δ (ppm) 193,3 (C=O), 161,7 (C2=O), 160,4 (C7), 155,5 (C8a), 151,2 (C4), 139,2 (Fenil-C4) , 133,3 (Fenil-C1), 130,3 (dos fenil-C2 y-C6), 129,4 (dos fenil-C3 y -C5), 126,8 (C5), 113,2 (C6), 112,6 (C3), 111,2 (C4a), 102,4 (C8), 71,1 (CH2), 41,8 (CH2). MS (m/z%): 362,08 (2,37, M+), 363,81 (4,51, M++ 2), 139,18 (100). Análisis elemental para C18H12Cl2O4, calculado: C, 59,53; H, 3,33; Encontrado: C, 59,74.; Alto, 3,58.

Se adoptó el mismo procedimiento utilizado para la síntesis de 5 y 6, excepto que se utilizaron los derivados de 7-hidroxicumarina 2-4 en lugar de 1.

Se adoptó el mismo procedimiento utilizado para la síntesis de los derivados 2 a 4, excepto que se utilizaron los derivados de cumarina 5 y 6 en lugar de 1.

A una solución de 1 (0,32 g, 1,5 mmol) en DMF (10 ml), la sal sódica apropiada del ácido benzoico (no) sustituido (1,5 mmol), K2CO3 anhidro (0,29 g, 3 mmol) y el bromuro de fenacilo apropiado ( 1,5 mmol). La mezcla de reacción se mantuvo en agitación a temperatura ambiente durante aproximadamente 4 h, se calentó a 90 °C durante la noche, luego se enfrió y se vertió sobre agua con hielo. Se encontró que los productos sólidos separados eran una mezcla impura de diferentes productos con rendimientos muy bajos.

Sólido pulido; Rendimiento 66%; Pf 242-244 °C. RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): δ 8,07 (d, 2H, J = 7,3 Hz, fenilo C2-H y C6-H), 7,96 (s, 2H, fenilo C2`-H y C6'-H) , 7,73 (t, 2H, J = 7,4 Hz, fenilo C4 -H y C4'-H) 7,68 (d, 1H, J = 8,7 Hz, C5-H), 7,59–7,57 (m, 4H, fenilo C3–H , C5–H, C3'–H y C5'–H), 6,85 (dd, 1H, J1 = 8,7 Hz, J2 = 2,0 Hz, C6-H), 6,78 (d, 1H, J = 2,0 Hz, C8– H), 6,28 (s, 1H, C3–H), 5,79 (s, 2H, COCH2), 5,60 (s, 2H, OCH2). RMN 13C (100 Hz, DMSO-d6), δ (ppm) 196,4 (C=O), 165,6 (C=O), 162,9 (C2=O), 160,6 (C7), 155,6 (C4), 150,9 ( C8a), 134,3 (dos Fenil-C4' y Fenil-C1'), 133,10 (dos Fenil-C1 y Fenil-C4), 129,9 (dos Fenil-C2 y C6), 129,5 (dos Fenil-C2` y C6`) , 129,3 (dos fenil-C3' y C5'), 128,4 (dos fenil-C3 y C5), 126,6 (C5), 113,7 (C6), 109,7 (C4a), 108,8 (C3), 102,9 (C8), 70,0 ( COCH2), 62,5 (OCH2). MS (m/z%): 414,14 (23,61, M+), 413,24 (6,94, M-H+), 105,12 (100). Análisis elemental para C25H18O6, calculado: C, 72,46; H, 4,38; Encontrado: C, 72,23; Alto, 4,57.

Blanco sólido; Rendimiento 51%; pf 245-247 °C. RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): δ 8,08 (d, 2H, J = 8,7 Hz, fenilo C2–H y C6–H), 8,05 (d, 2H, J = 8,9 Hz, fenilo C2'–H y C6'–H), 7,78 (d, 1H, J = 8,9 Hz, C5–H), 7,73 (t, 1H, J = 7,4 Hz, fenilo C4–H), 7,66 (d, 2H, J = 8,6 Hz, Fenilo C3'–H, C5'–H), 7,61 (t, 2H, J = 7,7 Hz, Fenilo C3–H, C5–H,), 7,18 (d, 1H, J = 2,3 Hz, C8–H), 7,09 (dd, 1H, J1 = 8,6 Hz, J2 = 2,3 Hz, C6-H), 6,41 (s, 1H, C3-H), 5,81 (s, 2H, COCH2), 5,64 (s, 2H, OCH2). RMN 13C (100 Hz, DMSO-d6): δ (ppm): δ 194,2 (C=O), 164,8 (C=O), 161,8 (C2=O), 160,4 (C7), 155,4 (C4), 150,5 ( C8a), 136,3 (Fenil-C4`), 134,7 (Fenil-C1`), 134,4 (Fenil-C1), 131,8 (Fenil-C4), 129,7 (dos Fenil-C2` y C6`), 129,3 (dos Fenil-C4`), C2 y C6), 128,4 (dos Fenil-C3` y C5`), 128,3 (dos Fenil-C3 y C5), 126,4 (C5), 113,4 (C6), 111,1 (C4a), 110,1 (C3), 102,4 (C8 ), 71,1 (COCH2), 62,8 (OCH2). MS (m/z%): 447,97 (12,78, M+), 450,63 (32,38, M++ 2), 43,19 (100). Análisis elemental para C25H17ClO6, calculado: C, 66,90; H, 3,82; Encontrado: C, 67,12; Alto, 3,97.

Cristales blancos; Rendimiento 77%; Pf 217-219 °C. RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): δ 8,10–8,07 (m, 4H, fenilo C2–H, C6–H, C2'–H y C6'–H), 7,78 (d, 1H, J = 8,9 Hz , C5–H), 7,73 (t, 1H, J = 7,4 Hz, fenilo C4'–H), 7,66 (d, 2H, J = 8,5 Hz, fenilo C3–H y C5–H), 7,61 (t, 2H , J = 7,6 Hz, Fenilo C3'–H y C5'–H), 7,18 (d, 1H, J = 2,4 Hz, C8-H), 7,09 (dd, 1H, J1 = 8,9 Hz, J2 = 2,4 Hz, C6-H), 6,41 (s, 1H, C3-H), 5,81 (s, 2H, COCH2), 5,64 (s, 2H, OCH2). RMN 13C (100 Hz, DMSO-d6): δ 194,2 (C=O), 164,8 (C=O), 161,8 (C2=O), 160,4 (C7), 155,3 (C4), 150,5 (C8a), 139,2 ( Fenil-C4), 134,6 (Fenil-C4'), 134,5 (Fenil-C1'), 131,8 (Fenil-C2), 131,8 (Fenil-C6), 129,7 (Fenil-C2'), 129,7 (Fenil-C6') , 129,4 (Fenil-C3'), 129,4 (Fenil-C5'), 128,4 (Fenil-C3), 128,4 (Fenil-C5), 128,2 (Fenil-C1), 126,4 (C5), 113,4 (C6), 111,1 ( C4a), 110,1 (C3), 102,4 (C8), 71,1 (CH2), 62,8 (CH2). MS (m/z%): 448,41 (38,92, M+), 450,14 (22,31, M++ 2), 447,68 (28,44, M+-1), 384,02 (100). Análisis elemental para C25H17ClO6, calculado: C, 66,90; H, 3,82; Encontrado: C, 66,83; H, 4,05.

cristales de color ante; Rendimiento 51%; Pf 228-230 °C. RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): δ 8,09–8,07 (m, 4H, fenilo C2–H, C6–H, C2`-H y C6`-H), 7,78 (d, 1H, J = 8,9 Hz , C5–H), 7,68–7,65 (m, 4H, fenilo C3–H, C5–H, C3'–H y C5'–H), 7,20 (d, 1H, J = 2 Hz, C8–H), 7,09 (dd, 1H, J1 = 8,9, J2 = 2,0 Hz, C6–H), 6,41 (s, 1H, C3–H), 5,78 (s, 2H, COCH2), 5,64 (s, 2H, OCH2). RMN 13C (100 Hz, DMSO-d6): δ 193,3 (C=O), 164,8 (C=O), 161,8 (C2=O), 160,4 (C7), 155,6 (C4), 150,7 (C8a), 139,2 ( dos Fenil-C4 y C4'), 131,8 (dos Fenil-C2 y C6), 130,4 (dos Fenil-C2' y C6'), 129,6 (dos Fenil-C3' y C5'), 129,4 (dos Fenil-C3 y C5), 128,3 (dos Fenil-C1 y C1'), 126,5 (C5), 113,9 (C6), 113,4 (C4a), 103,1 (C8), 102,4 (C3), 71,56 (CH2), 62,8 (CH2). MS (m/z%): 483,13 (35,54, M+), 485,01 (15,28, M++ 2), 141,69 (100). Análisis elemental para C25H16Cl2O6, calculado: C, 62,13; H, 3,34; Encontrado: C, 61,96; Alto, 3,56.

Blanco sólido; Rendimiento 45%; Pf 220-222 °C. RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): δ 8,06 (d, 2H, J = 7,7 Hz, fenilo C2'-H y C6'-H), 7,78 (d, 1H, J = 6,4 Hz, C5-H) , 7,76 (d, 1H, J = 8,7 Hz, fenilo C6-H), 7,73 (m, 1H, fenilo C4'-H), 7,64-7,62 (m, 3H, fenilo C3'-H y C5'-H y C4'H), 7,23 (d, 1H, J = 7,2 Hz, C6–H), 7,18 (s, 1H, C8-H), 7,09 (dd, 2H, J1 = 13,7, J2 = 6,5 Hz, fenilo C3- H y C5-H), 6,46 (s, 1H, C3-H), 5,81 (s, 2H, COCH2), 5,60 (s, 2H, OCH2), 3,88 (s, 3H, OCH3). RMN 13C (100 Hz, DMSO-d6): δ (ppm) 194,2 (C=O), 165,6 (C=O), 161,7 (C2=O), 160,4 (C7), 158,9 (Fenil-C2), 155,3 ( C4), 151,0 (C8a), 134,7 (Fenil-C4), 134,6 (Fenil-C4`), 134,4 (fenil-C1`), 131,6 (fenil-C6), 129,3 (Fenil-C2`), 129,3 (Fenil- C6`), 128,4 (Fenil-C3`), 128,4 (Fenil-C5`), 126,4 (C5), 120,8 (Fenil-C1), 119,4 (Fenil-C5), 113,2 (Fenil-C3), 113,1 (C6) , 111,1 (C4a), 109,8 (C3), 102,4 (C8), 71 (COCH2), 62,4 (OCH2), 56,28 (OCH3). MS (m/z%): 444,46 (9,60, M+), 77,32 (100). Análisis elemental para C26H20O7, calculado: C, 70,27; H, 4,54; Encontrado: C, 70,44; Alto, 4,63.

Blanco sólido; Rendimiento 51%; Pf 218-220 °C. RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): δ 8,07 (d, 2H, J = 8,2 Hz, fenilo C2'-H y C6'-H), 7,78 (d, 1H, J = 6,8 Hz, C5-H) , 7,74 (d, 1H, J = 7,7 Hz, fenilo C6–H), 7,69 (d, 2H, J = 8,3 Hz, fenilo C3'–H y C5'–H), 7,62 (t, 1H, J = 8,0 Hz, fenilo C4–H), 7,22 (d, 1H, J = 7,7 Hz, C6–H), 7,19 (s, 1H, C8–H), 7,09 (dd, 2H, J1 = 11,3 Hz, J2 = 7,7 Hz , Fenilo C3–H y C5–H), 6,46 (s, 1H, C3–H), 5,78 (s, 2H, COCH2), 5,60 (s, 2H, OCH2), 3,87 (s, 3H, OCH3). RMN 13C (100 Hz, DMSO-d6): δ (ppm) 193,3 (C=O), 165,6 (C=O), 161,6 (C2=O), 160,4 (C7), 158,9 (Fenil-C2`), 155,3 (C4), 150,9 (C8a), 139,2 (Fenil-C4`), 134,7 (Fenil-C4), 133,3 (Fenil-C1`), 131,7 (Fenil-C6), 131,6 (Fenil-C2`), 130,3 (Fenilo -C6`), 129,4 (Fenil-C3), 126,5 (Fenil-C3`), 126,4 (Fenil-C5`), 120,8 (C5), 119,4 (Fenil-C1), 113,2 (Fenil-C5), 113,1 (C6) ), 111,1 (C4a), 109,8 (C3), 102,3 (C8), 71,1 (COCH2), 62,3 (OCH2), 56,2 (OCH3). MS (m/z%): 478,24 (8,62, M+), 479,23 (18,46, M++ 1), 480,20 (12,17, M++ 2), 235,15 (100). Análisis elemental para C26H19ClO7, calculado: C, 65,21; H, 4,00; Encontrado: C, 65,03; H, 4,19.

Se añadió el derivado 2–4 apropiado (1,5 mmol) a una mezcla de anhídrido acético y ácido acético (1:1, 10 ml). La mezcla de reacción se calentó a reflujo durante 12 h, se enfrió y se vertió sobre hielo. Después se filtró el sólido bruto de color blanquecino, se lavó con agua y se secó. El sólido obtenido se recristalizó en etanol.

Blanco sólido; Rendimiento 71%; Pf 192-194°C. RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): δ 8,09 (d, 2H, J = 7,3 Hz, fenilo C2–H y C6–H), 7,92 (d, 1H, J = 8,6 Hz, C5–H), 7,73 (t, 1H, J = 7,1 Hz, fenilo C4–H), 7,59 (t, 2H, J = 7,4 Hz, fenilo C3–H y C5–H), 7,37 (s, 1H, C8–H), 7,25 ( d, 1H, J = 8,5 Hz, C6–H), 6,56 (s, 1H, C3–H), 5,66 (s, 2H, OCH2), 2,33 (s, 3H, COCH3). RMN 13C (100 Hz, DMSO-d6): δ (ppm) 169,2 (C=O), 165,5 (C=O), 159,8 (C2=O), 154,2 (C7), 153,6 (C4), 150,2 (C8a) , 134,3 (fenil-C4), 129,9 (dos fenil-C2 y C6), 129,4 (dos fenil-C3 y C5), 129,3 (fenil-C1), 126,4 (C5), 119,2 (C6), 115,3 (C4a), 112,7 (C8), 110,9 (C3), 62,5 (OCH2), 21,3 (COCH3). MS (m/z%): 338,55 (24,52, M+), 337,37 (18,27, M+-1), 280,45 (100). Análisis elemental para C19H14O6, calculado: C, 67,45; H, 4,17; Encontrado: C, 67,63; H, 4,39.

Sólido blanquecino; Rendimiento 88%; Pf 216-218 °C. RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): δ 8,09 (d, 2H, J = 8,2 Hz, fenilo C2–H y C6-H), 7,92 (d, 1H, J = 7,0 Hz, C5–H), 7,67 (d, 2H, J = 6,6 Hz, fenilo C3–H y C5–H), 7,37 (s, 1H, C8–H), 7,25 (d, 1H, J = 5,2 Hz, C6–H), 6,60 (s , 1H, C3–H), 5,67 (s, 2H, OCH2), 2,34 (s, 3H, COCH3). RMN 13C (100 Hz, DMSO-d6): δ (ppm) 169,4 (C=O), 165,4 (C=O), 159,4 (C2=O), 154,3 (C7), 153,6 (C4), 149,9 (C8a) , 134,6 (fenil-C4), 131,8 (dos fenil-C2 y C6), 129,6 (dos fenil-C3 y C5), 128,2 (fenil-C1), 126,4 (C5), 119,2 (C6), 115,5 (C4a), 112,8 (C8), 110,9 (C3), 62,7 (OCH2), 21,4 (COCH3). MS (m/z%): 372,14 (43,76, M+), 374,07 (63,76, M++ 2), 312,09 (100). Análisis elemental para C19H13ClO6, calculado C, 61,22; H, 3,52; Encontrado C, 61,39; Alto, 3,68.

Blanco sólido; Rendimiento 74%. pf 186-188 °C. RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6): δ 7,89 (d, 1H, J = 8,5 Hz, fenilo C6–H), 7,79 (d, 1H, J = 6,7 Hz, C5–H), 7,62 (t, 1H , J = 7,5 Hz, fenilo C4–H), 7,35 (s, 1H, C8–H), 7,25 (d, 1H, J = 7,9 Hz, C6–H), 7,22 (d, 1H, J = 8,8 Hz, Fenilo C3–H), 7,08 (t, 1H, J = 7,4 Hz, Fenilo C5–H), 6,63 (s, 1H, C3–H), 5,62 (s, 2H, OCH2), 3,88 (s, 3H, OCH3 ), 2,33 (s, 3H, COCH3). RMN 13C (100 Hz, DMSO-d6): δ (ppm) 169,3 (C=O), 165,6 (C=O), 158,9 (C2=O), 155,5 (fenil-C2), 154,2 (C7), 153,5 ( C4), 150,2 (C8a), 134,7 (fenil-C4), 131,6 (Fenil C6), 126,5 (Fenil-C1), 126,4 (fenil-C5), 120,7 (C5), 119,3 (C6), 115,2 (C4a), 113,5 (fenil-C3), 113,1 (C8), 109,6 (C3), 62,5 (OCH2), 56,2 (OCH3), 21,3 (COCH3). MS (m/z%): 368,36 (6,80, M+), 44,13 (100). Análisis elemental para C20H16O7, calculado: C, 65,22; H, 4,38; Encontrado C, 65,41; Alto, 4,45.

En este estudio, todos los compuestos sintetizados se analizaron inicialmente para determinar sus actividades antitumorales in vitro contra dos líneas celulares BC humanas, a saber, MCF-7 (estrógeno positivo) y MDA-MB-231 (triple negativo), para seleccionar las más prometedoras para exámenes adicionales mediante ensayo MTT utilizando doxorrubicina, como fármaco de referencia, como se describe en el método informado46,47.

Se examinaron catorce compuestos que mostraron buena actividad citotóxica contra la línea celular TNBC (MDA-MB-231) para un ensayo de inhibición de EGFR in vitro en relación con erlotinib como fármaco de referencia de acuerdo con el protocolo informado48.

Se examinaron once compuestos que mostraron buena actividad citotóxica contra la línea celular ER+ (MCF-7) para un ensayo de inhibición de ARO in vitro en relación con EXM como fármaco de referencia de acuerdo con el método informado49.

El análisis del ciclo celular por citometría de flujo de ADN se realizó en células MCF-7 tratadas con una concentración IC50 del compuesto 8 y en células MDA-MB-231 tratadas con una concentración IC50 de los compuestos 10, 12 y 14 según el procedimiento informado50.

El ensayo de tinción dual con anexina V-FITC/PI se realizó de acuerdo con el método informado51 para estudiar más a fondo la capacidad de los compuestos 8, 10, 12 y 14 para inducir la apoptosis mediante la introducción de un análisis basado en citometría de flujo.

Las células MCF-7 se trataron con el compuesto 8, mientras que las células MDA-MB-231 se expusieron a los compuestos 10, 12 y 14 según las instrucciones del fabricante52.

Las estructuras cristalinas de EGFR (PDB ID: 1M17) 18 y ARO (PDB ID: 3EQM) 53 se obtuvieron del PDB. En cuanto al ensayo de inhibición enzimática, se seleccionaron los compuestos más potentes para el estudio de acoplamiento utilizando el software Molecular Operating Environment (MOE).

Todos los datos del estudio se presentan en este artículo y sus archivos de información complementaria.

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Departamento de Química Orgánica Farmacéutica, Facultad de Farmacia, Universidad de Mansoura, Mansoura, 35516, Egipto

Fiby N. Takla, Waleed A. Bayoumi, Shahenda M. El-Messery y Magda NA Nasr

Departamento de Química Farmacéutica, Facultad de Farmacia, Universidad Delta de Ciencia y Tecnología, Carretera Costera Internacional, Ciudad de Gamasa, 35712, Egipto

Fiba N. Takla

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FT llevó a cabo la parte experimental. Todos los autores tienen contribuciones sustanciales e iguales en la concepción, diseño, análisis de datos, redacción y revisión del manuscrito.

Correspondencia a Shahenda M. El-Messery.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Takla, FN, Bayoumi, WA, El-Messery, SM et al. Desarrollo de agentes anticáncer de mama a base de cumarina de objetivos múltiples: estudio de síntesis y modelado molecular. Representante científico 13, 13370 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-40232-3

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Recibido: 10 de junio de 2023

Aceptado: 07 de agosto de 2023

Publicado: 17 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-40232-3

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