Modelado computacional y síntesis de variantes piridinas del benzoilo.

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 12236 (2023) Citar este artículo

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Los glioblastomas son tumores cerebrales muy agresivos para los que las opciones terapéuticas son muy limitadas. En la búsqueda de nuevos fármacos contra el glioblastoma, nos centramos en modificaciones estructurales específicas de la estructura de la benzoilfenoxiacetamida (BPA) presente en un fármaco hipolipemiante común, el fenofibrato, y en nuestro primer prototipo de fármaco contra el glioblastoma, PP1. Aquí, proponemos análisis computacionales extensos para mejorar la selección de los candidatos a fármacos para el glioblastoma más eficaces. Inicialmente, se analizaron más de 100 variaciones estructurales del BPA y sus propiedades fisicoquímicas, como la solubilidad en agua (− logS), el coeficiente de partición calculado (ClogP), la probabilidad de cruce de la BBB (BBB_SCORE), la probabilidad de penetración en el SNC (CNS-MPO) y la cardiotoxicidad calculada. (hERG), fueron evaluados. Este enfoque integrado nos permitió seleccionar variantes de piridina del BPA que muestran una mejor penetración en la BBB, solubilidad en agua y baja cardiotoxicidad. Aquí se sintetizaron y analizaron los 24 compuestos principales en cultivo celular. Seis de ellos demostraron toxicidad por glioblastoma con una IC50 que oscilaba entre 0,59 y 3,24 µM. Es importante destacar que uno de los compuestos, HR68, se acumuló en el tejido del tumor cerebral a 3,7 ± 0,5 µM, lo que supera su IC50 de glioblastoma (1,17 µM) en más de tres veces.

Los glioblastomas son las neoplasias cerebrales más agresivas con una tasa de supervivencia de los pacientes a 5 años lamentablemente baja, inferior al 5%1. Según la Organización Mundial de la Salud (OMS), los tumores gliales se clasifican en grado I y grado II (gliomas de bajo grado), grado III (anaplásico) y grado IV (glioblastoma)2. Las terapias de atención estándar actuales incluyen resección quirúrgica máxima, seguida de radioterapia más tratamiento concomitante y de mantenimiento con temozolomida (TMZ)3. Además, en los glioblastomas se ha encontrado una gran variedad de modificaciones genéticas y epigenéticas diferentes, entre las que las mutaciones p53, EGFR, PTEN e IDH son las más comunes4,5,6,7,8,9. Sin embargo, estos objetivos moleculares validados, así como las inmunoterapias, incluidos los inhibidores de puntos de control inmunitarios10, las vacunas contra tumores11 y las terapias con células T con receptor de antígeno quimérico (CAR T)12, se han estudiado ampliamente, pero no lograron mejorar significativamente el resultado terapéutico en pacientes con glioblastoma.

Hay varias razones por las que es difícil desarrollar terapias más efectivas para el glioblastoma: (1) Los glioblastomas se caracterizan por muchas vías desreguladas que no pueden bloquearse simultáneamente mediante una sola terapia13: (2) Los glioblastomas son tumores heterogéneos y altamente infiltrantes que son muy difíciles de tratar eliminar mediante resección quirúrgica sin comprometer la función de las áreas cerebrales circundantes14; (3) Es difícil diagnosticar los glioblastomas en sus primeras etapas, por lo tanto, en el momento del diagnóstico a menudo se presentan tumores grandes, altamente infiltrantes y vascularizados15; (4) El uso de modelos singénicos de roedores y derivados de pacientes es común para optimizar los protocolos clínicos. Un problema importante es que estos tumores experimentales suelen ser entre 103 y 104 más pequeños que los tumores reales en humanos. Por lo tanto, los datos de los experimentos de administración de fármacos, retención de fármacos y penetración tisular obtenidos de estos modelos de animales pequeños son difíciles de extrapolar a pacientes con glioblastoma16; y finalmente, (5) la barrera hematoencefálica (BHE) impide que la mayoría de los medicamentos contra el cáncer lleguen a los sitios tumorales en concentraciones clínicamente relevantes, y los métodos actuales para mejorar la penetración de la BHE no son muy efectivos para los pacientes con glioblastoma17.

Un fármaco que cruza fácilmente la BHE es la temozolomida (TMZ). Tras la administración oral, la concentración plasmática máxima de TMZ se puede alcanzar en aproximadamente una hora y la vida media de eliminación es de aproximadamente 1,8 h. Es importante destacar que se estima experimentalmente que la eficacia de penetración de TMZ en el sistema nervioso central (SNC) es aproximadamente del 20% de los niveles plasmáticos. Esto es importante porque la aplicación de esta estimación para calcular logBB (distribución cerebro-sangre)18 produce un valor de -0,7, lo que indica una alta capacidad del compuesto para cruzar la BBB. A pesar de estas características positivas, los pacientes con glioblastoma tratados con TMZ desarrollan resistencia a TMZ y los tumores recurrentes son prácticamente incurables19.

Además, TMZ se ha utilizado en combinación con otros fármacos, lo que potenciaba sus efectos terapéuticos. Un ejemplo es una combinación de TMZ con fármacos hipolipemiantes, incluidas estatinas20 y fibratos, como por ejemplo el fenofibrato (FF), que tiene una fuerte actividad antiglioblastoma en cultivos celulares y en modelos de glioblastoma intracraneal en ratones21. Sin embargo, también hemos descubierto que la capacidad del FF para cruzar la BHE es baja y que las esterasas sanguíneas y tisulares procesan rápidamente el compuesto para formar el agonista de PPARα, el ácido fenofíbrico (FFA), que ya no es eficaz para desencadenar tumores. muerte celular22. Hicimos numerosas modificaciones en la estructura química de FF y seleccionamos nuestro primer fármaco candidato, PP123, que, al igual que FF, bloquea la respiración mitocondrial y desencadena una depleción grave de ATP. Con el uso de ambas sustancias, al agotamiento de ATP le sigue la fosforilación/activación de la proteína quinasa activada por AMP (AMPK—sensor de energía intracelular), el bloqueo de la fosforilación de p70S6K (marcador de síntesis activa de proteínas), la activación de la autofagia (degradación de p62) y muerte celular extensa de glioblastoma24. A pesar de estos resultados prometedores, y a pesar del hecho de que detectamos PP1 en el cerebro en concentraciones terapéuticamente relevantes (Materiales complementarios, página 154), los efectos terapéuticos antiglioblastoma de PP1 fueron solo marginales cuando el tratamiento se aplicó a tumores intracraneales grandes. en ratones24. Estos datos indican que se necesitan continuamente ajustes adicionales al andamio de BPA, centrados en mejorar la citotoxicidad del compuesto, la penetración de la BHE y la retención en el tejido del tumor cerebral.

En las primeras etapas del diseño de fármacos, es importante evaluar las propiedades fisicoquímicas relevantes de los posibles fármacos candidatos. Durante más de dos décadas, la regla de cinco de Lipinski fue el estándar de oro en el diseño de fármacos25. Para los fármacos asociados con el SNC, su capacidad para cruzar la barrera hematoencefálica (BHE) es la característica más importante y no se aborda directamente en la regla de cinco de Lipinski. Por lo tanto, se han introducido dos sistemas de puntuación computacional para evaluar la probabilidad de que nuevos fármacos candidatos penetren en el SNC. Uno es el algoritmo de optimización multiparamétrica del SNC (CNS-MPO)26, que utiliza 6 propiedades fisicoquímicas [ClogP (coeficiente de partición calculado—lipofilicidad), ClogD (coeficiente de distribución calculado a pH fisiológico (7,4)—lipofilicidad), MW (peso molecular), TPSA ( área de superficie polar topológica), HBD (donante de enlaces de hidrógeno a pH = 7) y pKa (constante de disociación ácida -log)] para estimar la probabilidad de ingresar al SNC. El rango de puntuación de CNS-MPO está entre 0 y 6, y se han utilizado valores ≥ 4,0 como puntos de corte para compuestos con mayor capacidad para penetrar en el SNC26. Otro sistema de puntuación es la puntuación de la barrera hematoencefálica (BBB_SCORE)27. BBB_SCORE se basa en cinco parámetros fisicoquímicos que incluyen el número de anillos aromáticos, átomos pesados, MWHBN (un valor que comprende el peso molecular, el donante de enlaces de hidrógeno y el aceptor de enlaces de hidrógeno), pKa y área de superficie polar topológica. De manera similar a CNS-MPO, BBB_SCORE también considera el valor de 4,0 como el límite para una penetración BBB aceptable27. En consecuencia, CNS-MPO y BBB_SCORE sirven como algoritmos complementarios en los que CNS-MPO proporciona información sobre la probabilidad de que el compuesto se encuentre en el SNC, y BBB_SCORE está orientado hacia propiedades fisicoquímicas específicas que aumentan la probabilidad de que el compuesto cruce la BBB.

En lo que respecta a la toxicidad, uno de los obstáculos más comunes en las pruebas de drogas es la cardiotoxicidad provocada por la inhibición del canal de potasio cardíaco codificado por el gen humano relacionado con el éter-à-go-go (hERG). Esta prueba de toxicidad se convirtió en un requisito obligatorio para el diseño y desarrollo de fármacos y puede calcularse mediante el algoritmo hERG28,29. Según la estructura del compuesto, el algoritmo hERG proporciona una puntuación que es indicativa del efecto inhibidor del compuesto hacia hERG. En otras palabras, para que el fármaco se considere seguro, su hERG IC50 debe ser significativamente más alto que su IC5028 terapéutico.

Para determinar valores específicos de glioblastoma y terapéuticamente relevantes para todos los algoritmos/puntuaciones propuestos, incluido hERG, hemos seleccionado quince medicamentos (consulte Materiales complementarios, páginas 57 a 79) que se utilizan actualmente como medicamentos para el glioblastoma o se encuentran en ensayos clínicos. con pacientes con glioblastoma30. Los resultados en la Fig. 1B muestran que seis de estos compuestos (Fig. 1A) tienen una solubilidad en agua relativamente alta (LogS <0), baja lipofilicidad (logD <3), valores aceptables para CNS-MPO y BBB_SCORE (que oscilan entre 3 y 5). y baja toxicidad cardíaca (hERG ≤ 5,5). Utilizamos estos valores críticos como guía para diseñar nuevos candidatos a fármacos contra el glioblastoma, que se basan en la estructura química del BPA presente en un fármaco hipolipemiante común, el fenofibrato21,22,31,32, y en nuestro primer fármaco prototipo para el glioblastoma, PP123. ,24.

(A) Estructuras químicas de los fármacos de quimioterapia más comunes utilizados para tratar el cerebro y la médula espinal y sus propiedades psicofarmacológicas calculadas. (B) Propiedades fisicoquímicas calculadas para los compuestos representados en el Panel A. LogS = solubilidad en agua; logD = distribución a pH 7,4; CNS-MPO = algoritmo de optimización multiparamétrico del SNC; BBB_SCORE = puntuación de penetración de la barrera hematoencefálica; hERG = valor estimado de pIC50 para hERG (el canal de potasio humano ether-a-go-go (hERG)).

En la búsqueda de derivados de benzoilfenoxiacetamida (BPA) más eficaces, hemos decidido explorar variantes de piridina (Fig. 2). Esto se debe a que los restos de piridina son parte de un grupo diverso de compuestos con amplias aplicaciones farmacológicas33,34. Además, está bien documentado que los compuestos a base de piridina tienen una alta probabilidad de penetrar en el SNC35. En este documento, nos centramos en desarrollar y probar cinco variantes de BPA a base de piridina, que se agrupan según su relación estructural con los restos de piridina y amida: (I) una con un resto de piridina no sustituido directamente unido (piridina-BPA), (II) y uno con un resto de piridina no sustituido de separación con un carbono (metilenpiridina-BPA), (III) con dos carbonos (etilenpiridina), (IV) una piridina benzocondensada (benzopiridina-BPA, y (V) una piridina hidroxisustituida (hidroxipiridina-BPA ) (Figura 2).

Se seleccionó la región piridina del esqueleto de BPA para su modificación (círculo) en busca del fármaco antiglioblastoma óptimo.

Estas variaciones estructurales de las piridinas BPA se diseñaron y probaron utilizando valores calculados a partir de cuatro algoritmos: cardiotoxicidad (hERG)36; capacidad de penetración cerebral (CNS-MPO y BBB_SCORE) y solubilidad en agua (− logS). Los valores de las mejores 24 piridinas de BPA se presentan en la Fig. 3 (para obtener una lista completa de los valores calculados, consulte Materiales complementarios, páginas 77 a 138). Según nuestros cálculos iniciales, los compuestos de la Fig. 3 tienen una cardiotoxicidad baja (todos los valores de hERG previstos están por debajo de 5,5) y una solubilidad en agua aceptable (-logS estimado por debajo de 7,5). Además, las puntuaciones de CNS-MPO para casi todas las pirimidinas BPA son superiores a 3, lo que indica una probabilidad de penetración en el cerebro superior al 50%. Además, estos compuestos tienen un BBB_SCORE entre 4 y 5, lo que sugiere una alta probabilidad de cruzar el BBB.

Toxicidad estimada del canal cardiopotasio (hERG), penetrabilidad del SNC (CNS-MPO), penetrabilidad BBB (BBB_SCORE) y solubilidad en agua (-LogS) de las variantes de BPA basadas en piridina seleccionadas.

Después de determinar que las 24 piridinas BPA propuestas tienen una capacidad de penetración cerebral aceptable, solubilidad en agua y baja cardiotoxicidad, desarrollamos métodos de preparación específicos para cada compuesto. A partir de nuestros estudios anteriores, demostramos que el grupo carboxílico del ácido fenofíbrico (FFA) y sus derivados tienen una reactividad excepcionalmente baja hacia la sustitución de acilo nucleófilo. La vía sintética obvia para la preparación de estos compuestos es acoplar FFA con las aminas correspondientes37. Hay dos problemas principales al realizar el acoplamiento de FFA con aminopiridinas: (a) los FFA tienen una reactividad excepcionalmente baja debido a las restricciones estéricas generadas por los dos grupos metilo ubicados alfa con respecto al grupo carbonilo, y (b) los grupos amino de las aminopiridinas son nucleófilos excepcionalmente débiles debido a a la deslocalización de electrones del grupo amino a través del anillo de piridina. Otros38 examinaron recientemente la dificultad de realizar este tipo de reacción de acoplamiento. Sin embargo, los FFA se pueden convertir en el correspondiente cloruro fenofíbrico (Fig. 4), que es suficientemente reactivo con las aminas alifáticas y las anilinas activadas. Pero las reacciones de acoplamiento con aminopiridinas como la 4-aminopiridina son, en el mejor de los casos, un desafío. Este es un inconveniente importante para el diseño de fármacos porque existen amplias aplicaciones para las estructuras de piridina en la química medicinal34. Por estas razones, hemos decidido explorar la nucleofilia de las aminopiridinas a través de sus datos computacionales.

Procedimiento para la preparación de derivados piridina del BPA (para obtener más detalles, consulte "Métodos" y materiales complementarios, páginas 2 a 56).

En moléculas de estructura estructural similar, es posible comparar orbitales moleculares de frontera para determinar el orden de reactividad nucleofílica y electrófila39. Hemos utilizado la teoría del funcional de densidad para calcular las energías HOMO. Los resultados proporcionados en Materiales complementarios (página 153) indican que las aminopiridinas deberían ser menos reactivas (bajo HOMO) en comparación con la anilina, mientras que el aminofenol es más nucleofílico. Según nuestros cálculos, el acoplamiento de FFA estéricamente impedido a través del cloruro fenofíbrico reactivo (FFC) con 4-aminofenol debería dar un producto con un rendimiento altamente aislado. Nuestros estudios anteriores23,40 demostraron que el FFC es un intermediario FFA reactivo y viable para el acoplamiento de aminas. Por estas razones, hemos desarrollado una nueva metodología sintética, que se muestra en la Fig. 4.

Hay dos grupos distintivos de compuestos HR desde el punto de vista de la reactividad de las aminas y su preparación (a) uno con un anillo heterocíclico aromático directamente unido al átomo de nitrógeno (HR66-HR70, HR82, HR83, HR88-HR90), y (b ) uno con separación de un anillo heterocíclico aromático por uno o dos carbonos alifáticos (HR71-HR81, HR84-HR87). La preparación del segundo grupo de compuestos (con aminas reactivas) es sencilla mezclando FFC con las aminas correspondientes en presencia de una base. Debido a que las aminas correspondientes son más nucleofílicas que el agua y las reacciones se completan en varios minutos a temperatura ambiente, estas reacciones se pueden realizar con una base respetuosa con el medio ambiente, como el carbonato de sodio en agua. Los rendimientos aislados son casi cuantitativos y este método (Método A) es muy adecuado para síntesis a pequeña (miligramos) y gran escala (cientos de gramos). Además, este procedimiento sintético no requiere precauciones ni preparaciones especiales. La preparación del primer grupo, con el anillo aromático heterocíclico directamente unido al grupo amino, requiere ciertas precauciones. Debido a que el agua es un mejor nucleófilo que estas aminas, la reacción debe realizarse en condiciones libres de agua (secas). Además, las aminas menos nucleófilas también son propensas a la oxidación en condiciones básicas40. Debido a esto, dichas reacciones deben llevarse a cabo en una atmósfera libre de oxígeno (Método B). En condiciones secas, se mezcló una solución de piridina de una aminopiridina correspondiente con carbonato de sodio anhidro y se mantuvo en atmósfera de nitrógeno durante la noche. También se preparó una solución separada de FFC en diclorometano en condiciones secas bajo una atmósfera de nitrógeno. La solución de diclorometano se añadió lentamente a una suspensión de piridina fría (~ 0–5 °C) de una aminopiridina correspondiente y carbonato de sodio en una atmósfera de nitrógeno. Se obtuvieron rendimientos casi cuantitativos con reacciones realizadas a 0–5 °C durante 3 h, luego a temperatura ambiente durante la noche y, finalmente, a 60 °C durante 3 h adicionales. El producto se aisló después de la evaporación del disolvente y la adición de agua mediante filtración simple y lavado extenso con agua. Este método proporcionó productos con alto rendimiento, más del 97% de pureza, y no requirió purificación adicional ni mediante extracción ni cromatografía. También es aplicable a escalas de preparación de miligramos y multigramos para aminas con amplios rangos de reactividad (Fig. 4).

El primer grupo de variantes de piridina-BPA se presenta en la Fig. 5 en la que se estima la viabilidad de las células de glioblastoma (CV basada en el ensayo MTT), el área de proyección mínima (MPA), la lipofilicidad (ClogD), la polarizabilidad molecular (PL), así como , Se determinó la energía del orbital molecular desocupado más bajo (ELUMO) y la energía del orbital molecular más ocupado (EHOMO). Hemos incluido el MPA en base a estudios que muestran que si un compuesto no interactúa con las membranas celulares y tiene un MPA inferior a 60 Å2, debería poder penetrar el SNC mediante difusión pasiva41,42,43. Por lo tanto, el MPA se considera un mejor parámetro que el peso molecular para discriminar la capacidad del compuesto de ingresar al SNC44.

Candidatos a fármacos basados en BPA con fracción piridina. (A) Viabilidad celular (ensayo MTT) evaluada después de la exposición de células de glioblastoma (LN229) a 25 μM de las correspondientes pirimidinas BPA. Los datos indican valores promedio con desviación estándar (n = 3). (B) Valores tabulados para parámetros relevantes para el glioblastoma. CV = Viabilidad celular (% del control) media ± DE a 25 μM; ClogD = coeficiente de distribución calculado a pH fisiológico (lipofilicidad); MPA = Área de Proyección Mínima (Å2); PL = Polarizabilidad molecular (Å3); ELUMO = energía de LUMO (Orbital Molecular Desocupado más bajo) (eV); EHOMO = Energía del HOMO (Orbital Molecular Ocupado Más Alto) (eV). (C) Gráficos de IC50 e imágenes de las células a 5 y 25 µM para HR67 y HR68, que se consideran los candidatos a fármacos más prometedores en este grupo. Los datos representan valores promedio con desviación estándar (n = 3).

En el contexto de la comparación de compuestos con alta similitud estructural, las energías orbitales de frontera (HOMO y LUMO) se pueden utilizar para determinar cuál de los compuestos similares puede tener una mayor capacidad de unión a proteínas y, por lo tanto, una mayor probabilidad de penetración en la BHE45,46.

En este sentido, HR67 y HR68 (Fig. 5) tienen energías HOMO y LUMO bajas, junto con una lipofilicidad aceptable (ClogD) y valores IC50 de glioblastoma muy prometedores (0,59 y 1,17 µM, respectivamente), lo que indica que estos dos compuestos podrían convertirse en Principales candidatos para el desarrollo de fármacos contra tumores cerebrales.

El siguiente grupo de compuestos pertenece a la metilenpiridina-BPA (Fig. 6). Todos estos compuestos muestran una actividad antiglioblastoma prometedora a 25 µM, y sus distribuciones estimadas (ClogD) son relativamente altas, lo que indica una alta lipofilicidad. Los valores de MPA están por debajo de 60, lo que sugiere que no hay ningún obstáculo para la penetración del SNC en cuanto al tamaño molecular. La polarizabilidad (PL) está entre 40 y 50, lo que indica que estas moléculas pueden adaptarse al área de unión de una biomolécula mediante polarización complementaria47. En la consideración de energías orbitales de frontera calculadas (LUMO y HOMO), HR74 debería tener la mejor capacidad de unión. Además, todos los compuestos HR en la Fig. 6 son altamente citotóxicos a 25 µM excepto HR75, y los valores IC50 correspondientes para los compuestos más prometedores de este grupo, HR73 y HR76, son 3,24 y 2,87 µM, respectivamente.

Candidatos a fármacos con fracción metilenpiridina. (A) Viabilidad celular (ensayo MTT) evaluada después de la exposición de células de glioblastoma (LN229) a 25 μM de las correspondientes pirimidinas BPA. Los datos indican valores promedio con desviación estándar (n = 3). (B) Valores tabulados para parámetros relevantes para el glioblastoma. CV = Viabilidad celular (% del control) media ± DE a 25 μM; ClogD = coeficiente de distribución calculado a pH fisiológico (lipofilicidad); MPA = Área de Proyección Mínima (Å2); PL = Polarizabilidad molecular (Å3); ELUMO = energía de LUMO (Orbital Molecular Desocupado más bajo) (eV); EHOMO = Energía del HOMO (Orbital Molecular Ocupado Más Alto) (eV). (C) Gráficos de IC50 e imágenes de las células a 5 y 25 µM para HR73 y HR76, que se consideran los candidatos a fármacos más prometedores en este grupo. Los datos representan valores promedio con desviación estándar (n = 3).

A continuación, preguntamos si la actividad del compuesto cambiaría al agregar un conector de etileno a etilenpiridina-BPA o al aumentar la deslocalización molecular de la piridina en benzopiridina-BPA (Fig. 7). Como se esperaba, al aumentar el número de átomos de carbono, ya sea añadiendo un grupo metileno o un anillo aromático adicional, la lipofilicidad aumentó notablemente (por ejemplo, ClogD para HR83 es 7,29). A medida que aumenta el tamaño de la molécula, siguen los valores de MPA, lo que sugiere que HR81, HR82 y HR83 pueden tener bajas probabilidades de penetrar en el SNC. Teniendo en cuenta las energías de ambos orbitales moleculares fronterizos de tres compuestos similares (HR78, HR79 y HR80), HR80 debería ser el más activo. De hecho, los datos de viabilidad celular (CV) obtenidos para estos compuestos se correlacionaron con datos computacionales y sugieren que el mejor candidato a fármaco de este grupo es HR80. Aunque ambas benzopiridinas-BPA (HR82 y HR83) tienen valores de IC50 alentadores, 1,4 y 2,75 µM, respectivamente, sus propiedades físicas calculadas, como ClogD y MPA, sugieren que existe una probabilidad muy baja de que estos compuestos penetren en el SNC, lo que respalda aún más HR80 como el mejor fármaco candidato para el glioblastoma en este grupo. Además, aquí se utilizó HR81, que tiene una baja citotoxicidad específica de glioblastoma (Fig. 7A) como control negativo para los cálculos de IC50 (Fig. 7C).

Candidatos a fármacos con restos de etilenpiridina y benzopiridina. (A) Viabilidad celular (ensayo MTT) evaluada después de la exposición de células de glioblastoma (LN229) a 25 μM de las correspondientes pirimidinas BPA. Los datos indican valores promedio con desviación estándar (n = 3). (B) Valores tabulados para parámetros relevantes para el glioblastoma. CV = Viabilidad celular (% del control) media ± DE a 25 μM; ClogD = coeficiente de distribución calculado a pH fisiológico (lipofilicidad); MPA = Área de Proyección Mínima (Å2); PL = Polarizabilidad molecular (Å3); ELUMO = energía de LUMO (Orbital Molecular Desocupado más bajo) (eV); EHOMO = Energía del HOMO (Orbital Molecular Ocupado Más Alto) (eV). (C) Gráficos de IC50 e imágenes de las células a 10, 20 y 40 µM para HR82, HR83 y HR81 (control negativo para la toxicidad específica del glioblastoma). Los datos representan valores promedio con desviación estándar (n = 3).

También hemos explorado la importancia que la quiralidad puede tener en la actividad de estos compuestos (Figura 8). Por ejemplo, HR84 y HR85 son isómeros estructurales de HR78 que muestran una citotoxicidad moderada a 25 µM (CV = 26,33). Existen diferencias notables entre los dos estereoisómeros: el isómero R HR84 es tres veces más citotóxico que el isómero S HR85 (Figura 8). Por otro lado, no hay diferencia entre el HR86 racémico (ambos R&S) y el isómero R ópticamente puro HR87. Este hallazgo es razonable debido a la proximidad del nitrógeno piridina al centro quiral. Se podría argumentar que la unión de nitrógeno de piridina está estéricamente disminuida en HR85 en comparación con HR84. Debido a la posición del nitrógeno piridina con respecto al centro quiral, la diferencia estérica disminuye en HR87, lo que se asocia con una mejor citotoxicidad. Los hidroxipiridina-BPA pueden existir tanto en forma de hidroxipiridina como de amida, siendo preferible la forma de amida en 8,97 kcal/mol según el método computacional DFT ωB97X-D/6-31G*. Los estudios computacionales y la espectroscopía de RMN indican que HR88 está en forma de hidroxipiridina, mientras que HR89 y HR90 están en forma de amida.

Candidatos a fármacos con moietis de metilenpiridina e hidroxipiridina quiral. (A) Viabilidad celular (ensayo MTT) evaluada después de la exposición de células de glioblastoma (LN229) a 25 μM de las correspondientes pirimidinas BPA. Los datos indican valores promedio con desviación estándar (n = 3). (B) Valores tabulados para parámetros relevantes para el glioblastoma. CV = Viabilidad celular (% del control) media ± DE a 25 μM; ClogD = coeficiente de distribución calculado a pH fisiológico (lipofilicidad); MPA = Área de Proyección Mínima (Å2); PL = Polarizabilidad molecular (Å3); ELUMO = energía de LUMO (Orbital Molecular Desocupado más bajo) (eV); EHOMO = Energía del HOMO (Orbital Molecular Ocupado Más Alto) (eV). (C) Gráficos IC50 e imágenes de las células a 5 y 25 m para HR87 y HR90. Los datos representan valores promedio con desviación estándar (n = 3).

De los tres hidroxipiridina-BPA, solo se pueden comparar los datos calculados para HR89 y HR90 porque están en forma de amida, mientras que HR88 está en forma de hidroxipiridina. Todos los parámetros calculados sugieren que tanto HR89 como HR90 deberían penetrar fácilmente en el SNC. Sin embargo, las energías orbitales de frontera calculadas para HR90 son más bajas, lo que indica que debería ser más eficaz para penetrar la BBB. Además, la citotoxicidad del glioblastoma inducida por HR90 es casi 10 veces mayor en comparación con HR89, lo que convierte a HR90 en el mejor fármaco candidato. En conclusión, HR87 y HR90 son los mejores candidatos a fármacos en este grupo con valores de CI50 correspondientes específicos de glioblastoma de 5,38 y 2,05 µM, respectivamente (Fig. 8C).

Al buscar nuevos fármacos candidatos, es muy importante prever los posibles metabolitos y estimar sus propiedades fisicoquímicas, incluida la toxicidad48. Utilizamos métodos computacionales para generar metabolitos de todos los compuestos estudiados y luego evaluamos su toxicidad, solubilidad, lipofilicidad y penetración en el SNC utilizando el método BioTransformer49. Aquí solo se informan los resultados de nuestros mejores candidatos a fármacos, HR67 y HR68 (Materiales complementarios, página 155). Los tipos de reacciones involucradas en el metabolismo de la Fase I son hidrólisis, oxidación y reducción50. Todos los metabolitos previstos de HR67 y HR68 tienen una solubilidad en agua calculada mejor o comparable, así como capacidades calculadas para penetrar en el SNC. Es importante destacar que se prevé que todos estos metabolitos sean relativamente seguros (los valores de hERG oscilan entre 5,76 y 4,95), con la excepción de la hidrólisis de amida, que puede desencadenar cierta toxicidad cardíaca y debe analizarse más a fondo (hERG = 3,91) (Materiales complementarios, página 155).

Nuestros datos presentados en las Figs. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 8 nos permitieron realizar una selección imparcial y de alto rendimiento de compuestos a base de BPA, que tienen buenas posibilidades de convertirse en candidatos a fármacos para el glioblastoma. Posteriormente se probaron dos variantes de pirimidina de BPA, HR67 (PP23) y HR68 (PP21), para determinar su capacidad para penetrar membranas modelo BBB artificiales (Fig. 9A, B). En este experimento, se compararon los valores de permeabilidad de BBB (P) entre los dos fármacos experimentales, HR67 y HR68, nuestro prototipo de fármaco candidato, PP124, y un control positivo (cafeína). También comparamos el control negativo (FF), para el cual previamente hemos demostrado una incapacidad para acumularse en el tejido del tumor cerebral22. Aunque las puntuaciones CNS-MPO para HR67 (3,71) y HR68 (3,71) son ligeramente más bajas, en comparación con las puntuaciones CNS-MPO de nuestro fármaco prototipo, PP1 (CNS-MPO = 3,9)23,24, estos dos compuestos pueden cruzar el modelo BBB. membrana (Fig. 9B). Es importante destacar que hemos detectado HR68 en el tejido del tumor cerebral en concentraciones más de 3 veces superiores a la IC50 específica del glioblastoma para este compuesto (1,17 µM) (Fig. 9C), lo que indica aún más su potencial como nuevo fármaco candidato para el glioblastoma.

Penetración de compuestos de PP seleccionados a través de la membrana del modelo BBB in vitro: (A) Representación esquemática de un modelo de cocultivo triple de la BBB, que consta de astrocitos, pericitos y células epiteliales cultivadas en membranas transwell de 24 pocillos con poros de 3 μm. La resistencia eléctrica transendotelial (TEER) se midió utilizando un medidor EVOM2 con un electrodo STX3 (World Precision Instruments). (B) La permeabilidad BBB (P) para los compuestos seleccionados se calculó usando la ecuación P = VA⋅CA/(t⋅S⋅CL)51 y se normalizó mediante el coeficiente TEER. Los datos representan valores promedio de 2 experimentos independientes por triplicado (n = 6) con desviación estándar SD. * indica valores significativamente diferentes del fenofibrato (control negativo), y se utilizó cafeína como control positivo. Panel C: concentración tisular de HR68 (PP21) evaluada en ratones desnudos Foxn1 portadores de glioblastoma intracraneal (GBM12). Los ratones fueron tratados por vía intraperitoneal (ip) con HR68 diluido en ciclodextrina al 20% a 15 mg/kg/día y se determinaron los niveles de HR68 en sangre, corazón, hígado, riñón, bazo, pulmón, cerebro y en tumores cerebrales (BT). evaluado por HPLC, como informamos anteriormente21,24. Los datos representan valores promedio con desviación estándar (n = 3). Tenga en cuenta que el IC50 promedio de glioblastoma para HR68 es de 1,17 µM y detectamos 3,7 ± 0,5 µM de HR68 en el tejido del tumor cerebral.

En conclusión, la introducción de restos de piridina en la estructura de BPA mejora las propiedades quimiofarmacológicas de los nuevos fármacos candidatos. En particular, la solubilidad en agua y la penetración prevista en el SNC de estos derivados de piridina del BPA son mayores que en los derivados alquílicos y fenólicos del BPA estudiados previamente23,52. También se demostró aquí que un resto de piridina colocado correctamente con respecto a la estructura de BPA aumentaba la potencia antiglioblastoma de estos compuestos con valores de IC50 específicos de glioblastoma cercanos a 1 µM. Es importante destacar que estas modificaciones específicas, que aumentaron la flexibilidad molecular y mejoraron la solubilidad en agua de los compuestos, se lograron sin comprometer la citotoxicidad específica del glioblastoma. Además, la estereoquímica del centro quiral cercano al resto de piridina es importante debido a una diferencia en la orientación tridimensional del nitrógeno de piridina, que puede cambiar la interacción del compuesto con biomoléculas específicas.

Todo el trabajo intelectual, experimental y colaborativo incluido en este manuscrito ha sido aprobado por la Junta de Ética de Luisiana y aprobado de acuerdo con las directrices y regulaciones pertinentes por el Comité Institucional de Bioseguridad de la Universidad Estatal de Luisiana (LSU) (IBC, protocolo #4351). y el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de LSU (IACUC, protocolo #4966). Además, nuestros experimentos con animales aprobados por la IACUC siguen 10 recomendaciones esenciales incluidas en la directriz ARRIVE.

Todos los materiales de partida eran de grado reactivo y se compraron en AmBeed (https://www.ambeed.com), Millipore Sigma (https://www.sigmaaldrich.com) y TCI America (https://www.tcichemicals.com). . Los espectros de 1H-NMR se registraron en instrumentos Varian Mercury 300 y Varian Mercury 400 Plus en CDCl3 y DMSO-d6, utilizando los cambios químicos del disolvente como estándar interno. Los disolventes de RMN se adquirieron de Cambridge Isotope (//www.isotope.com). En el disolvente DMSO-d6, nuestros compuestos finales, como HR68, muestran dos conjuntos de señales debido a la rotación restringida del enlace amida CN53. Esta restricción no está presente en CDCl3 como disolvente de RMN [Ver datos complementarios; págs. 9-13]. Todos los compuestos estudiados tienen una pureza del 96 % o superior, según se determina con H-NMR y HPLC. Todos los descriptores moleculares calculados fueron generados por ChemAxon MarvinSketch versión 22.21 (https://chemaxon.com/products/marvin). Todos los valores calculados para todos y cada uno de los compuestos se realizaron con MarvinSketch y se incluyen en los materiales complementarios. Las energías orbitales de frontera, los estudios conformacionales, las diferencias de energía entre varios isómeros y sus mapas de potencial electrostático se calcularon con el método de Teoría funcional de densidad (DFT) ωB97X-D/6-31G* implementado en Spartan '18 v 1.1.0 (https:// www.wavefun.com) y se incluyen en los materiales complementarios (páginas 150 a 152). Los espectros de 1H-NMR y 13C-NMR para todos los compuestos HR generados en este estudio se incluyen en Materiales complementarios. La predicción de los metabolitos de la fase I se realizó con BioTransformer 3.0 (https://biotransformer.ca/new) [Wishart DS, Tian S, Allen D, Oler E, Peters H, Lui VW, Gautam V, Djoumbou-Feunang Y, Greiner R, Metz A. BioTransformer 3.0: un servidor web para predecir con precisión los productos de transformación metabólica54.

(Método general aplicable para la preparación de todos los compuestos HR66-HR90 a gran escala sin extracción ni cristalización). Preparación de 2-[4-(4-clorobenzoil)fenoxi]-2-metil-N-(piridin-3-il)propenamida (HR67). Se sonicó una suspensión de piridina seca de 3-aminopiridina (14,2 g; 0,15 mol) y carbonato de sodio anhidro (42,4 g; 0,4 mol) durante treinta minutos y se dejó a temperatura ambiente en un sistema cerrado durante la noche bajo una atmósfera de nitrógeno para asegurar que la suspensión de piridina permaneciera. seco. Por separado, se preparó cloruro fenofíbrico (FFC) de la siguiente manera: se agitaron diclorometano (500 ml), suspensión de ácido fenofíbrico (47,4 g; 0,15 mol), cloruro de oxalilo (25,7 ml; 38,1 g; 0,3 mol) y DMF (unas pocas gotas). a temperatura ambiente durante la noche. Después de aproximadamente 1,5 h, la mezcla de reacción adquirió un color marrón claro. La mayor parte del disolvente se eliminó mediante destilación a presión atmosférica y el disolvente restante se eliminó bajo flujo de argón a temperatura ambiente. El material sólido resultante se disolvió en diclorometano (150 ml), bajo una atmósfera de nitrógeno y con agitación lenta, se añadió a la suspensión de piridina previamente preparada de 3-aminopiridina y carbonato de sodio enfriada con agua con hielo. La suspensión resultante se agitó a 0–5 °C durante 3 h, luego a temperatura ambiente durante la noche y se agitó a 60 °C durante 3 h más. El disolvente resultante se eliminó a presión reducida para separar el residuo sólido. Este residuo se mezcló con agua (1 litro) y se agitó mediante sonicación durante 4 h. El producto cristalino blanco insoluble se separó por filtración, se lavó extensamente con agua (20 x 100 ml) y se secó a 60 °C, al vacío. El rendimiento aislado fue del 90% (53,3 g). RMN 1H (DMSO-d6, 400 MHz) δ 10,31 (1H, s), 8,83 (1H, s), 8,26 (1H, d, J = 4,4 Hz), 8,06 (1H, d, J = 8,4 Hz), 7,72 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,67 (2H, d, J = Hz), 7,54 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,31 (1H, d de d, J1 = 8,4 Hz, J2 = 4,4 Hz), 7,04 (2H, d, J = 8,8 Hz) y 1,63 (6H, s) ppm. 13C-RMN (DMSO-d6, 100 MHZ) δ 193,7, 172,9, 159,4, 145,2, 142,6, 137,6, 136,6, 135,6, 132,3, 131,6, 130,6, 129,0, 128,0, 123,9, 118,8, 81,5 y 25,2 ppm.

Preparación general de HR71-HR81 y HR84-HR87 a gran escala con carbonato de sodio en agua como base. Preparación de 2-(4-(4-clorobenzoil)fenoxi)-2-metil-N-(2-(piridin-4-il)etil)propenamida (HR80). Se preparó cloruro fenofíbrico (FFC) (0,3 mol) mediante el siguiente procedimiento descrito en el Método A a partir de ácido fenofíbrico (95,6 g; 0,3 mol) y cloruro de oxalilo (63,5 g; 43 ml) en diclorometano (1 l). Se añadió lentamente gota a gota FFC preparado (0,3 mmol) durante un período de 45 min a temperatura de baño de agua helada en una mezcla agitada magnéticamente de carbonato de sodio (106 g; 1 mol) en agua (500 ml) y 1-(piridina-4). -il)etanamina (24,4 g; 0,2 mmol) en tetrahidrofurano (500 ml). Una vez completada la adición, la mezcla de reacción resultante se agitó a temperatura ambiente durante la noche. El volumen de la mezcla de reacción se redujo en un 75 % mediante la evaporación del disolvente bajo flujo de aire (producida por una bomba de aire). La suspensión blanca resultante se mezcló con agua (500 ml) y el producto insoluble se separó mediante filtración, se lavó con agua (10 x 50 ml) y se secó a 50 °C durante la noche. El rendimiento aislado fue del 97% (82 g) de producto puro. El filtrado se acidificó con ácido clorhídrico hasta pH = 2. El precipitado sólido blanco resultante se separó mediante filtración, se lavó con agua (10 x 20 ml) y se secó a 50 °C durante la noche para dar 34,2 g (95 % de recuperación) de ácido fenofíbrico. . RMN 1H (DMSO-d6, 400 MHz) δ 8,36 (2H, d, J = 4,8 Hz), 8,21 (1H, t, J = 5,2 Hz), 7,66 (6H, m), 7,13 (2H, d, J = 5,2 Hz), 6,86 (2H, d, J = 8,0 Hz), 3,85 (2H, m), 2,73 (2H, t, J = 7,2 Hz) y 1,45 (6H, s) ppm. RMN 13C (DMSO-d6, 400 MHz) δ 193,7, 173,1, 159,6, 149,7, 148,7, 137,5, 136,7, 132,1, 131,6, 130,2, 129,1, 124,6, 118,7, 81,1, 3 9,4, 34,3 y 25,5 ppm.

Preparación a pequeña escala aplicable a todos los HR66-HR90. Preparación de 2-(4-(4-clorobenzoil)fenoxi)-2-metil-N-(2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)propanamida (HR89). Se preparó una solución de cloruro de ácido fenofíbrico en diclorometano (5 ml) recién preparada a partir de ácido fenofíbrico (80 mg; 0,25 mmol) y cloruro de oxalilo (1 mmol) como se describió anteriormente. Estos se añadieron, bajo una atmósfera de nitrógeno mientras se agitaba, a piridina (10 ml)-tetrahidrofurano (10 ml)-carbonato de sodio (212 mg; 2 mmol) de 3-aminopiridin-2(1H)-ona (27,5 mg; 0,25 mmol) solución. La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente en una atmósfera de nitrógeno durante 3 h, seguido de agitación bajo una atmósfera de nitrógeno a 60 °C durante 3 h más. Después de enfriar hasta temperatura ambiente, el disolvente se evaporó bajo un flujo de aire (producido por una bomba de aire) a temperatura ambiente dando un residuo sólido. Este residuo sólido se mezcló con diclorometano (30 ml) y? agua (100 ml). Se descartó la capa acuosa y la capa orgánica se lavó con agua (3 x 100 ml), carbonato de sodio al 5% (3 x 100 ml) y se secó sobre carbonato de sodio anhidro. El material de secado se separó por filtración. El volumen del filtrado se redujo a ~2 ml, después se añadieron hexanos (~10 ml). La solución resultante se dejó descubierta a temperatura ambiente, permitiendo que el disolvente se evaporara lentamente. El producto cristalino blanco resultante se separó por filtración, se lavó con hexano (3 x 3 ml) y se secó al aire durante la noche. Rendimiento aislado = 93% (95 mg). RMN 1H (DMSO-d6, 400 MHz) δ 12,08 (1H, s), 9,29 (1H, s), 8,24 (1H, d de d, J1 = 7,2 Hz, J2 = 1,6 Hz), 7,73 (2H, d , J = 8,8 Hz), 7,71 (2H, d, J = 8,8 Hz), 7,59 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,12 (1H, m), 7,10 (2H, d, J = 8,8 Hz), 6,26 (1H, t, J = 7,2 Hz) y 1,58 (6H, s) ppm. RMN 13C (DMSO-d6, 100 MHz) δ 193,8, 172,4, 158,5, 157,6, 137,7, 136,4, 132,3, 131,7, 131,6, 129,1, 128,7, 128,6, 123,1, 120,3, 105,9, 82,3 y 25,2 ppm.

Se mantuvieron células de glioblastoma humano LN-229 (ATCC CRL-2611) como un cultivo en monocapa semiconfluente en DMEM con 1 g/l de glucosa, piruvato de sodio y L-glutamina (Corning), suplementado con FBS al 10% inactivado por calor (Gibco ) y P/S (50 unidades/mL de penicilina y 50 µg/mL de estreptomicina) a 37 °C en una atmósfera de 5% de CO2. Antes del tratamiento con compuestos HR, las células se sembraron en placas de 96 pocillos (BD Falcon) a una densidad inicial de 2 x 104 células/cm2. Veinticuatro horas después del cultivo en placas, se prepararon soluciones madre de compuestos HR en DMSO, se diluyeron en medio de cultivo celular y se agregaron a las células previamente sembradas por triplicado para cada condición experimental (concentración final 25 µM). Se utilizó DMSO (0,5%) como control del vehículo. Después de 72 h de incubación, se realizó un ensayo MTT para medir la actividad metabólica celular (sustituto de la viabilidad celular). Después de una incubación de 1,5 h con 0,5 mg/ml de MTT en DMEM libre de suero con bajo contenido de glucosa, los cristales de formazán resultantes se disolvieron en HCl 5 mM en isopropanol y se leyó la absorbancia a 540 nm. Los datos representan valores medios expresados como porcentaje de control del vehículo ± DE. Se tomaron imágenes de contraste de fase de las células tratadas 72 h después del tratamiento con compuestos HR utilizando un microscopio de fluorescencia BZ-X800 (Keyence) equipado con un objetivo de 20 ×. La dosis del fármaco que resultó en una inhibición del 50% de la actividad metabólica celular (sustituto de la viabilidad celular) se midió usando el ensayo MTT, en el momento de 72 h, y la concentración inhibidora máxima media (CI50) se calculó usando GraphPad Prism 8.

La BBB se recreó in vitro utilizando un protocolo modificado proporcionado por Stone et al.55. Brevemente, se recubrieron insertos Transwell de 24 pocillos (Falcon, número de catálogo 353096) con 10 μg/cm2 de colágeno tipo IV (Sigma) durante 24 h a 4 °C. Los insertos se lavaron con agua esterilizada y se secaron al aire durante 2 h. A continuación, los insertos se recubrieron con 2 μg/cm2 de poli-l-lisina (ScienCell) durante 1 h a 37 °C, luego se lavaron dos veces con H2O estéril y se secaron al aire durante 2 h. Los astrocitos humanos primarios (1,5 × 105) y 3 × 104 pericitos humanos primarios (ambos ScienCell) se resuspendieron en 25 μl de medio de astrocitos y medio de pericitos (ScienCell), respectivamente, y luego se combinaron en una proporción de 1: 1 para un volumen total de 50 μl. Los insertos recubiertos y secos se voltearon de manera que la superficie basolateral quedó expuesta en la parte superior, y se agregaron 50 µl de la mezcla celular a la membrana, se cubrieron con la tapa de la placa y se incubaron durante 2 h a 37 °C para permitir que las células adhesión. Cualquier medio restante en la parte superior de la membrana se eliminó cuidadosamente antes de devolver los insertos a su posición vertical con la superficie apical hacia arriba, mientras se colocaban en una placa de 24 pocillos que contenía 500 µl por pocillo de medio de astrocitos/pericitos (1:1). . Se agregaron 300 μL adicionales de medio al compartimento apical. Cuatro días después del cultivo en placas, se eliminó el medio del compartimento apical y se agregaron 3,75 × 104 de células endoteliales vanas inmortalizadas con telomerasa (TIVE; proporcionadas por el Dr. Rolf Renne) en 50 μl de medio TIVE56 y se incubaron durante 5 h a 37 °C. para permitir la unión celular, seguido de la adición de 250 l adicionales de medio TIVE. La mitad del volumen de los medios correspondientes en los compartimentos inferior y superior se reemplazó con medios nuevos cada tres días. Diez días después del recubrimiento inicial, se midió la resistencia eléctrica transendotelial (TEER) utilizando un medidor EVOM2 con un electrodo STX3 (World Precision Instruments). La capacidad de compuestos HR seleccionados para atravesar la BHE in vitro se probó utilizando insertos con BBB reconstruida de manera efectiva, según lo confirmado por los valores de TEER55,57.

Después de la medición de TEER, el medio del compartimento apical (inserto) del modelo BBB in vitro (Fig. 9A) se reemplazó con 350 µl de medio TIVE nuevo que contenía los compuestos correspondientes [HR67 (PP23), HR68 (PP21), ambos usados en 25 µM. Además, se utilizó como control negativo fenofibrato (FF) 25 µM, que no cruza la BBB22, y cafeína 50 µM como control positivo58. Las placas que contenían los insertos se devolvieron a la incubadora (37 °C, 5 % de CO2) y, después de 3 h de incubación, se recogieron los medios condicionados del pocillo y el inserto (Fig. 9A). Posteriormente, las alícuotas (100 µl) de las muestras recolectadas se mezclaron con 100 µl de acetonitrilo al 100 %, se centrifugaron (16.000 rpm a 4 °C durante 10 minutos) y se recogieron los sobrenadantes para la detección basada en HPLC de HR67 y HR68.

Los análisis de HPLC se realizaron utilizando un sistema UltiMate 3000 (Thermo Scientific) equipado con una columna analítica YMCbasic, 3 µm, 150 × 4,6 mm (octilsilano C8; YMC America, Inc.). La elución isocrática de los compuestos se realizó utilizando una fase móvil compuesta de disolvente A (ácido acético 50 mM en dH2O) y disolvente B (acetonitrilo) mezclados en proporciones predeterminadas para cada compuesto (Tabla 1). Todas las separaciones se llevaron a cabo con un volumen de muestra de 5 μl a un caudal de 1 ml/min, a 25 °C. La concentración de cada compuesto se calculó utilizando diluciones en serie de la concentración conocida del compuesto separada en la misma serie con muestras experimentales y de control. Después de la separación, se usaron áreas integradas bajo el pico para preparar curvas de calibración y determinar la concentración de los compuestos.

En este estudio se utilizaron ratones hembra inmunodeficientes Foxn1nu de 6 a 8 semanas de edad (tanto los machos como las hembras se ven afectados de manera similar por el glioblastoma). Los ratones fueron inoculados con glioblastoma derivado del paciente, resistente a GBM12-TMZ, que expresa de manera estable el indicador de luciferasa24,59, fueron amablemente proporcionados por el Dr. Sarkaria (Cleveland Clinic, Brain Tumor National Resource) y se cultivaron y propagaron de acuerdo con los protocolos recomendados59 . Las células se inyectaron en la región del cuerpo estriado utilizando 5 µl de PBS que contenía 1 x 105 de las células tumorales guiadas por el enfoque estereotáctico [1,5 mm posterior a Bregma; 1,5 mm lateral a la sutura sagital; 3 mm hacia abajo desde la superficie] como se informó en nuestro estudio anterior24. El tratamiento comenzó cuando los tumores intracraneales estaban bien establecidos (evaluados por el sistema de imagen óptica para animales pequeños (Xenogen IVIS CT). La solución inyectable HR68 se preparó a partir de la solución madre de DMSO 50 mM diluida en ciclodextrina al 20% (2-hidroxipropil-β -ciclodextrina) en PBS estéril y se administró por vía intraperitoneal (ip) a 15 mg/kg. Posteriormente se recogieron sangre, hígado, riñones, bazo, corazón, cerebro y tumor cerebral, se lavaron tejidos sólidos de la sangre en PBS y se colocaron en hielo para una preparación inmediata de la muestra para el análisis de HPLC (ver arriba). Los tejidos se prepararon para HPLC mezclando 150 μl de tejido de muestra (~ 120 mg) que se había mezclado con 3 volúmenes de mezcla de metanol: H2O (4:1), bien mezclada. utilizando TissueRuptor II (Qiagen), y se centrifugó a 15.000 g durante 10 min a 4 ° C. Los sobrenadantes se recogieron en tubos Eppendorf de 1,5 ml y se incubaron a 95 ° C durante 3 min. Después de enfriar instantáneamente en hielo, las muestras se centrifugaron nuevamente a 15.000 g durante 10 min a 4 °C y los sobrenadantes se utilizaron para la medición basada en HPLC.

Los datos se analizaron con una prueba t de Student homocedástica. Las diferencias entre los grupos control y experimental se consideraron significativas con valores de P ≤ 0,05.

Los conjuntos de datos utilizados y/o analizados durante el presente estudio están disponibles del autor correspondiente previa solicitud razonable.

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Este trabajo fue apoyado por P20-GM121288-01 (KR), 1R41CA275433 (KR) y LSU-2022-CCRI-8 (KR/GK). Todos los estudios químicos y computacionales fueron respaldados por STEPFARM, LLC. (BSJ).

Departamento de Química, Universidad de Nueva Orleans, Nueva Orleans, LA, 70148, EE. UU.

Charles H. Ingraham IV, Sean C. Carson y Branko S. Jursic

Stepharm LLC., PO Box 24220, Nueva Orleans, LA, 70184, EE. UU.

Branko S. Jursic

Investigación del Cáncer Neurológico, Departamento de Medicina, Centro Oncológico Stanley S. Scott, Centro de Ciencias de la Salud LSU, Nueva Orleans, LA, 70112, EE. UU.

Charles H. Ingraham IV, Joanna Stalinska, Susan B. Colley, Monica Rak, Adam Lassak, Francesca Peruzzi y Krzysztof Reiss

Investigación del Cáncer Neurológico, Departamento de Oncología Interdisciplinaria, Centro de Ciencias de la Salud LSU, Nueva Orleans, LA, 70112, EE. UU.

Charles H. Ingraham IV, Joanna Stalinska, Susan B. Colley, Monica Rak, Adam Lassak, Francesca Peruzzi y Krzysztof Reiss

Departamento de Biología Celular, Facultad de Bioquímica, Biofísica y Biotecnología, Universidad Jagellónica, Cracovia, Polonia

Joanna Stalinska y Monika Rak

WayPath Pharma, Centro de BioInnovación de Nueva Orleans (NOBIC), 1441 Canal Str., Nueva Orleans, LA, 70112, EE. UU.

Carlos H. Ingraham IV y Krzysztof Reiss

Oficina de Subvenciones y Desarrollo, Stanley S. Scott Cancer Center, LSU Health Sciences Center, Nueva Orleans, LA, 70112, EE. UU.

Susan B. Colley

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CI: participó en la realización de reacciones químicas específicas diseñadas por BSJ. Realizó y ayudó en el diseño de análisis de cultivos celulares, pruebas de toxicidad celular, microscopía, imágenes, análisis de datos, interpretación de estudios in vitro y preparación de figuras, así como edición y esfuerzos conceptuales relacionados con el diseño final del manuscrito; JS: realizó y ayudó en el diseño de análisis de cultivos celulares, pruebas de toxicidad celular, imágenes celulares, análisis de datos y preparación de figuras para experimentos de cultivos celulares; MR: realizó múltiples experimentos de cultivo celular, pruebas de toxicidad celular e imágenes celulares luego de la salida de JSSCC: participó en la realización de reacciones químicas específicas diseñadas por BSJ; AL: evaluación basada en HPLC de la concentración de HR68 en cultivos celulares y en tejidos de ratón; SBC: edición y esfuerzo conceptual relacionado con el diseño final del manuscrito. FP: Contribución tanto conceptual como experimental durante la revisión. Todos los autores revisaron el manuscrito; KR: ayudó a diseñar experimentos de cultivo celular, fue autor de secciones del manuscrito relacionadas con glioblastoma, cultivo celular, toxicidad celular e interpretación de estudios de cultivo celular; BSJ: diseñó estrategias químicas para el desarrollo de nuevos compuestos HR, realizó las reacciones químicas correspondientes, análisis computacionales de los nuevos compuestos, fue autor de la sección del manuscrito relacionada con el desarrollo de modificaciones químicas y análisis computacionales.

Correspondencia a Krzysztof Reiss o Branko S. Jursic.

El Dr. Branko Jursic está asociado con Stepharm LLC, PO Box 24220, Nueva Orleans, LA; El Dr. Reiss está asociado con WayPath Pharma LLC. 217 Sena Dr. Metairie LA 70005. El Dr. Krzysztof Reiss y el Dr. Branko Jursic tienen una patente provisional de LSU para los compuestos HR presentados en este manuscrito (“Composición anticancerígena y métodos de uso” 2932719-056-us2). Otros autores no tienen ningún interés competitivo en relación con esta presentación.

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Reimpresiones y permisos

Ingraham, CH, Stalinska, J., Carson, SC et al. Modelado computacional y síntesis de variantes de piridina de benzoil-fenoxiacetamida con alta citotoxicidad de glioblastoma y penetración de tumores cerebrales. Informe científico 13, 12236 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-39236-w

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Recibido: 03 de abril de 2023

Aceptado: 21 de julio de 2023

Publicado: 28 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-39236-w

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