Evaluación de la biocompatibilidad in vitro de células madre de pulpa humana con injertos alogénicos, aloplásticos y xenogénicos bajo la influencia de vesículas extracelulares.

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 12475 (2023) Citar este artículo

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Las terapias que utilizan células madre de pulpa dental (DPSC) o vesículas extracelulares (EV) derivadas de células madre han mostrado aplicaciones prometedoras para la ingeniería de tejido óseo. Este experimento in vitro evaluó la capacidad osteogénica articular de DPSC y EV en injertos óseos aloplásticos (maxresorp), alogénicos (maxgraft) y xenogénicos (cerabone). Nuestra hipótesis es que la diferenciación osteogénica y la proliferación de DPSC humanas varían entre los injertos óseos y son favorables bajo la influencia de los vehículos eléctricos. Las DPSC se obtuvieron de muelas del juicio humanas y las EV derivadas de las DPSC se aislaron del medio de cultivo celular. Se sembraron DPSC en sustitutos de injertos óseos aloplásticos, alogénicos y xenogénicos para el control, y se administraron vehículos eléctricos a los mismos armazones en otros grupos. La absorción celular de vehículos eléctricos en células DPSC se evaluó mediante microscopía de barrido láser confocal. Se utilizaron tinción de vitalidad celular y tinción de éster acetoximetílico de calceína para evaluar la unión y proliferación celular. La morfología celular se determinó mediante microscopía electrónica de barrido y la diferenciación osteogénica se exploró mediante tinción con fosfatasa alcalina y rojo de alizarina. Dentro de las limitaciones de un estudio in vitro sin patologías, los resultados sugieren que especialmente el uso de sustitutos de injertos óseos xenogénicos con DPSCS y EV puede representar un enfoque de tratamiento prometedor para los defectos óseos alveolares.

Los defectos óseos de la cresta alveolar suelen producirse como resultado de la pérdida de dientes, inflamación, traumatismo o patología y plantean problemas importantes durante la rehabilitación dental o implantológica. Por tanto, los procedimientos de aumento tienen como objetivo generar suficiente volumen óseo para la colocación del implante1. Se pueden utilizar diferentes materiales de injerto óseo para aumentar los defectos óseos. Debido a sus propiedades osteogenéticas, osteoinductivas y osteoconductoras, los injertos óseos de origen autólogo representan el estándar de oro para el tratamiento de defectos óseos en la mandíbula humana, aunque se asocian con importantes inconvenientes como la morbilidad del lado del donante2, múltiples cirugías requeridas y aumento de los tiempos de operación3. Además del hueso autólogo, se pueden utilizar sustitutos de injertos óseos (BGS) alogénicos, xenogénicos y aloplásticos para aumentar los defectos óseos. Los sustitutos óseos ofrecen la ventaja de eliminar la morbilidad por extracción, pero actualmente son inferiores al hueso autólogo en términos de osteogénesis, osteoinducción y osteoconducción. Por tanto, se han realizado muchas investigaciones para mejorar las propiedades de los BGS.

Las células madre mesenquimales multipotentes (MSC) son células madre adultas que pueden aislarse de una amplia variedad de tejidos4,5,6,7. En el año 2000, se aislaron MSC por primera vez a partir de tejido pulpar sano de terceros molares extraídos8. Además de su rápida proliferación y capacidad de formación de colonias9, las MSC derivadas de DPSC han indicado un fuerte potencial de diferenciación para osteoblastos, adipocitos, condrocitos, odontoblastos y neuronas10. En comparación con las MSC derivadas de la médula ósea, las DPSC tienen una tasa de proliferación más alta10, son células clonogénicas y tienen un potencial regenerativo prometedor para tratar daños tisulares graves, todo lo cual convierte a las DPSC en un tipo de células madre frecuentemente estudiado entre las MSC en investigación. La capacidad de diferenciarse en células formadoras de hueso convierte a las DPSC en una opción terapéutica prometedora en la medicina regenerativa de la deficiencia ósea3,11.

La evidencia reciente sugiere que los efectos regenerativos beneficiosos de la terapia basada en células madre probablemente estén orquestados por sus procesos paracrinos9,12,13,14,15,16,17. Los vehículos eléctricos son secretados por las células de forma paracrina, están rodeados por una estructura de bicapa lipídica y tienen un diámetro de aproximadamente 150 a 180 nm. Contienen sustancias genéticas como los microARN (miARN) y los VE forman parte de la comunicación entre células en forma de exosomas o microvesículas18,19,20,21. Los microARN son componentes de ARN no codificantes que inhiben la traducción del ARNm. Por tanto, son un componente elemental de la proliferación y diferenciación celular22. La especificidad objetivo y los genes moduladores de los miRNAS están relacionados con la osteogénesis y, en consecuencia, promueven la diferenciación osteogénica de las MSC y, por tanto, inducen la regeneración del tejido óseo23.

El deterioro causado por las enzimas degradativas a menudo ha limitado el uso de miARN en estudios de remodelación ósea en el pasado24. Estas limitaciones podrían superarse mediante la producción de vehículos eléctricos de origen natural, ya que estas vesículas pueden usarse para transportar miARN a las células diana25. Los vehículos eléctricos tienen la ventaja de obtenerse fácilmente a partir de fluidos corporales o de cultivos celulares26,27, y se caracterizan por su estabilidad con baja susceptibilidad, provocan poca respuesta inmune, si es que la hay, y tienen un efecto de localización intrínseco, que favorece la absorción de vehículos eléctricos con miARN osteogénicos. por las células diana28. Por lo tanto, se están ampliando nuevos enfoques de la terapia con células madre para incluir el uso de vehículos eléctricos9,13.

Teniendo en cuenta que las EV y las DPSC desempeñan un papel importante en las terapias celulares16, y que las EV pueden modular potencialmente la proliferación y diferenciación de las DPSC en la osteogénesis, una investigación de las DPSC en diferentes estructuras e interacciones de las EV parece esencial para el desarrollo de nuevas terapias para el tratamiento óseo. defectos. Actualmente, un número insuficiente de estudios ha investigado la respuesta celular osteogénica de las DPSC bajo la influencia de vehículos eléctricos en diferentes BGS convencionales in vitro. Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue investigar la internalización de los vehículos eléctricos en las DPSC y determinar la influencia en la unión, el crecimiento y la diferenciación osteogénica de las DPSC en estructuras óseas aloplásticas, xenogénicas y alogénicas bajo la influencia de los vehículos eléctricos.

Como se describió anteriormente29, las DPSC se generaron a partir de 3 terceros molares retenidos extraídos en hombres adultos sanos en el Departamento de Cirugía Oral y Maxilofacial de la Universidad RWTH Aachen. Todos los métodos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices y regulaciones pertinentes de la aprobación ética del Comité de Ética de la Facultad de Medicina de la Universidad RWTH Aachen (EK 374/19). Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes. Los dientes se colocaron en clorhexidina antes de abrirlos con fresas de fisuras dentales estériles en la unión cemento-esmalte. Se utilizaron brochas de púas estériles para diseccionar el tejido pulpar de la corona y la raíz. Antes del aislamiento de DPSC, se preparó una solución enzimática mixta usando 1 ml de colagenasa tipo I (12 mg/ml), 1 ml de dispasa (16 mg/ml) en 2 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) estéril que contenía 100 mg/ml de penicilina y 100 mg/ml de estreptomicina. El tejido de pulpa picada se transfirió a la solución enzimática preparada para la digestión durante 60 minutos a 37 °C y se agitó cada 30 minutos. Utilizando un tamiz celular de 70 μM, se eliminaron los agregados de células grandes para obtener una suspensión unicelular. La digestión se terminó mediante la adición de 3 ml de medio esencial mínimo (MEM) que contenía suero bovino fetal (FBS) al 10 % (v/v). Luego, las suspensiones unicelulares se centrifugaron a 1000 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente. Después de retirar el sobrenadante, los sedimentos se resuspendieron en 1 ml de medio celular y se cultivaron en una placa de cultivo celular de 25 cm2 a 37 °C en una incubadora con una atmósfera de 5 % de CO2 y 100 % de humedad relativa. Después de aproximadamente 3 a 5 días, las DPSC adherentes migraron hacia afuera desde los trozos de tejido pulpar. Brevemente, las DPSC aisladas se cultivaron en medio MEM básico (medio de crecimiento) libre de EV que contenía 10 % (v/v) de FBS y 1 % (v/v) de solución antibiótica-antimicótica a 37 °C en una incubadora con 5 % de CO2. atmósfera y 100% de humedad relativa. La actualización del medio se realizó cada dos días. En los ensayos posteriores se utilizaron DPSC en las etapas 3 a 5. La inducción de la diferenciación osteogénica se realizó cultivando DPSC en medio de diferenciación osteogénica suplementado con ácido ascórbico 0,1 mM, dexametasona 100 nM y β-glicerofosfato 10 mM.

Después de alcanzar aproximadamente el 80% de confluencia, las DPSC se enjuagaron dos veces con PBS y se cultivaron durante otras 24 h en medio sin FBS. Para eliminar los desechos celulares y las células no adheridas, se recogieron los sobrenadantes, se centrifugaron diferencialmente (300 g, 2000 gy 5000 g) durante 15 minutos a 4 ° C y se filtraron con un filtro de 0,22 μm; Luego se descartó el sedimento. Luego, el sobrenadante se transfirió a un tubo de ultracentrífuga y se sometió dos veces a ultracentrifugación a 20.000 g durante 90 minutos a 4 °C para sedimentar los EV derivados de DPSC. Los gránulos se resuspendieron en 100 μl de PBS estéril para obtener una suspensión de EV homogénea y luego se almacenaron a -80 °C para su posterior aplicación.

Luego se utilizó el análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) para probar la concentración cuantitativa y la distribución del tamaño de partículas de los vehículos eléctricos derivados de DPSC. Todas las muestras se diluyeron hasta un volumen final de 1 ml usando PBS. Se realizó una prueba previa para evaluar la concentración de medición ideal de 20 a 100 partículas por cuadro; ver la figura 1a. Los ajustes se implementaron de acuerdo con el manual del software del fabricante (NanoSight NS300). Además, la morfología y el tamaño de los DPSC-EV aislados se evaluaron mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM) (Fig. 1b-d). Se sedimentaron un total de 10 μl de DPSC-EV, se resuspendieron en 10 μl de tampón HEPES y se dejaron caer sobre una rejilla de cobre recubierta de carbono para observaciones TEM.

Examen de las características de los vehículos eléctricos derivados de DPSC: el número y el tamaño de los vehículos eléctricos se analizaron mediante (a) análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) con NanoSight NS300. (b – d) La forma de los vehículos eléctricos se examinó mediante análisis de electrones de transmisión (TEM). e Ilustra la internalización celular de EV marcados con WSA (fluorescencia roja) en células DPSC positivas para DAPI (fluorescencia azul) después de 1 h, 3 h y 8 h.

En este estudio in vitro se utilizaron injertos óseos particulados disponibles comercialmente (tamaño de partícula de 0,5 a 2 mm). Utilizamos maxresorb (botiss biomaterials GmbH, Alemania) como armazón aloplástico de fosfato de calcio bifásico (BCP). Para la estructura alogénica, utilizamos maxgraft (botiss biomaterials GmbH, Alemania), un aloinjerto óseo liofilizado. Para el injerto óseo xenogénico, utilizamos cerabone (botiss biomaterials GmbH, Alemania), un mineral óseo bovino desproteinizado.

En primer lugar, los EV aislados derivados de DPSC se marcaron fluorescentemente con una sonda de lectina molecular, conjugados de aglutinina de germen de trigo (WGA, conjugado Alexa Fluor 488), durante 30 minutos a temperatura ambiente antes de terminarlos mediante centrifugación a 20.000 g durante 90 minutos y resuspenderlos en PBS. Estos vehículos eléctricos marcados con WGA se cultivaron conjuntamente con DPSC (5 × 104/placa confocal) durante diferentes tiempos (1 h, 3 h y 8 h); Luego, las células se lavaron con PBS y se fijaron en paraformaldehído al 4%. Luego se tiñó el núcleo celular con 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (n.º de catálogo 2381700, Invitrogen, EE. UU.) durante otros 15 minutos. La absorción celular de vehículos eléctricos marcados con WGA por parte de las DPSC después de diferentes tiempos de incubación se observó mediante microscopía de barrido láser confocal (CLSM). Además, las imágenes de reconstrucción 3D a partir de fluorescencia WGA y DAPI se formaron automáticamente utilizando el software ZEN lite en diferentes momentos (Fig. 1e).

Después de cultivar durante 7 días, se evaluaron las morfologías celulares en varios armazones óseos bajo intervención de EV a una densidad inicial de 20.000 células/placa mediante tinción de citoesqueleto y microscopía electrónica de barrido (SEM). Para la evaluación de la organización del citoesqueleto, las muestras de armazón celular se pretrataron con EV y luego se enjuagaron dos veces con PBS y se fijaron en paraformaldehído al 4% durante 20 minutos, seguido de un pretratamiento con Triton X-100 (0,1% v/ v) durante 5 min. Luego, las muestras se tiñeron conjuntamente con rodamina-faloidina (n.º de catálogo R415, Invitrogen, Alemania) para visualizar actina F y DAPI (n.º de catálogo 2381700, Invitrogen, Alemania) para visualizar los núcleos durante 45 min y 5 min. , respectivamente. La visualización de la muestra se realizó después de 1 h, 3 h y 8 h mediante CLSM, y se obtuvieron imágenes de pila Z para la construcción 3D.

Para las observaciones SEM, las construcciones de armazón celular en varios grupos se lavaron suavemente dos veces con tampón PBS, se fijaron con glutaraldehído al 2,5 % durante 4 h y luego se deshidrataron con una serie de diferentes concentraciones de etanol (30 %, 50 %, 70 %, 90% y 100%) dos veces. A continuación, las construcciones de célula/andamio se secaron durante la noche de acuerdo con un protocolo establecido30 y luego se pulverizaron con Au/Pd y se observaron usando SEM (XL30 FEG; FEI, Eindhoven, Países Bajos) con un voltaje de aceleración de 10 kV.

Posteriormente, las BGS sembradas con células se cultivaron en placas confocales a una densidad inicial de 20.000 células/placa durante 3 o 7 días. La mitad de las muestras se sometieron a estimulación EV (5 × 109 partículas/ml). En cada momento predeterminado, se descartó el medio y las células se lavaron tres veces. Se realizaron dos tinciones diferentes, según las instrucciones del fabricante: (1) tinción con calceína AM de células vivas (n.º de cat. PK-CA707-30002, PromoKine, Alemania) y (2) tinción con DAPI (n.º de cat. 2381700, Invitrogen, USU ). Las células DPSC que crecían en los armazones óseos se enjuagaron tres veces y se observaron mediante CLSM para determinar el efecto proliferativo.

Se utilizó un kit de ensayo de células vivas/muertas (PromoKine, PromoCell GmbH, Alemania) para detectar la viabilidad celular a partir de la actividad esterasa intracelular y la integridad de la membrana plasmática de las DPSC. Se sembraron DPSC en los tres armazones de injerto óseo diferentes (20.000 células/placa) en el medio osteogénico durante 1, 3, 5 y 7 días. Luego, los andamios se enjuagaron dos veces con PBS tibio y las células se marcaron con un tinte de fluorescencia mixto que contenía calceína AM 2 μM y homodímero III de etidio 4 μM (EthD-III) durante 45 minutos, según las instrucciones del fabricante. Finalmente, la relación entre fluorescencia verde y fluorescencia roja se analizó utilizando el software ImageJ. (El software Java gratuito fue proporcionado por los Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD, EE. UU.).

Se utilizó tinción con fosfatasa alcalina (ALP) para evaluar la diferenciación osteogénica de fase temprana y tardía en todos los grupos después de 7 y 14 días de cultivo. En resumen, se aspiró el medio de cultivo y las DPSC se lavaron suavemente con tampón PBS dos veces. Se añadió una solución fijadora y luego se incubó a temperatura ambiente. Después de 5 minutos, se aspiró la solución fijadora y se añadió solución de tinción ALP (n.º de catálogo GR3358974-1, Abcam Co., Reino Unido) en la oscuridad y se incubó a temperatura ambiente durante 15 minutos más. La observación de células positivas para ALP (ALP+) se realizó mediante microscopía óptica y se analizó utilizando el software ImageJ.

Se utilizó tinción con rojo de alizarina (ARS) (n.º de catálogo 3512879, Merck, Alemania) para determinar la formación de nódulos mineralizados de diferenciación osteogénica de fase tardía mediante deposición de calcio. Después de la incubación osteogénica durante 14 días, las células de varios grupos se enjuagaron dos veces con PBS, se fijaron en paraformaldehído al 4% durante 10 minutos y luego se tiñeron con solución de ARS al 0,1% (40 mM, pH 4,2) en oscuridad durante 25 minutos a temperatura ambiente. . Estos precipitados mineralizados se observaron y fotografiaron mediante un microscopio óptico y se analizaron utilizando el software ImageJ. Los nódulos mineralizados aparecieron como un centro de color rojo oscuro y un área periférica de color rojo claro.

Los análisis se realizaron utilizando Prism 7.0 (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, EE. UU.). Antes del análisis, los valores se probaron utilizando los criterios de la prueba de D'Agostino-Pearson o Shapiro-Wilk para distribución normal y pasaron la prueba de Brown-Forsythe para varianzas iguales. Se utilizó un ANOVA de dos vías para analizar los datos paramétricos de los grupos con respecto a dos variables categóricas diferentes: la variable uno incluye los diferentes materiales óseos y la variable dos la presencia o ausencia de EV. Se realizó una prueba de comparación múltiple de Tukey post hoc, con varianzas individuales calculadas para cada comparación. Los datos de este artículo representan las medias ± desviación estándar (DE). Las diferencias entre los grupos se consideraron significativas cuando p < 0,05.

El rendimiento de EV obtenidos a partir de DPSC tuvo una concentración medida de 2 × 109 nanopartículas/ml. Al confirmar que el tamaño de la vesícula y la morfología de los vehículos eléctricos obtenidos en el estudio presentado aquí mostraron similitudes con los valores de la literatura, se utilizaron NTA a través de NanoSight NS300 y TEM para caracterizar los vehículos eléctricos. Las imágenes SEM ilustraron que los vehículos eléctricos tenían una morfología típica en forma de copa con diferentes diámetros hidrodinámicos (Fig. 1b-d). La NTA reveló vehículos eléctricos en el rango de tamaño de aproximadamente 184,9 ± 67,0 nm. Las imágenes SEM también mostraron que los vehículos eléctricos aislados tenían formas similares, lo que en conjunto demostró que los métodos de aislamiento habían dado como resultado lotes de vehículos eléctricos homogéneos.

La Figura 1e muestra la interacción de los EV marcados con WGA y los DPSC con núcleos teñidos con DAPI. Después de un período de incubación de 1 h, inicialmente se incorporaron pocas EV al citoplasma de las DPSC. Fueron evidentes pocos vehículos eléctricos WSA positivos cerca de los núcleos teñidos con DAPI. Durante la duración consecutiva de 3 a 8 h, notamos una absorción constante y una acumulación creciente de vehículos eléctricos en el espacio citoplasmático.

En DPSC monocultivadas con EV, se observó una abundancia de fibras de actina F en todos los materiales de injerto óseo bajo la influencia de EV. Las imágenes fluorescentes que se muestran en las figuras 2a a c indican una distribución homogénea de las fibras de actina y el alargamiento de los filamentos de las DPSC en BGS aloplásticos, alogénicos y xenogénicos. Morfológicamente, no se observaron diferencias entre los grupos en la tinción de la actina del citoesqueleto de las DPSC bajo la influencia de los vehículos eléctricos.

(a – c) Muestra una distribución homogénea de fibras de actina y el alargamiento de los filamentos de DPSC bajo la influencia de vehículos eléctricos en (a) andamios aloplásticos, (b) alogénicos yc xenogénicos. Los aumentos de las imágenes de la izquierda fueron de 400 × y las imágenes del medio de 600 ×. Las imágenes de la derecha son reconstrucciones en 3D. (d – o) Fotografías de microscopía electrónica de barrido del día 7 de los cultivos celulares DPSC. (d, e) muestran DPSC en un andamio aloplástico. (f, g) DPSC + EV en andamio aloplástico. (h, i) muestra DPSC en un andamio alogénico. (j, k) DPSC + EV en andamio alogénico. (l, m) muestran DPSC en un andamio xenogénico. (n, o) DPSC + EV en andamio xenogénico.

Las imágenes SEM del día 7 (Fig. 2) de los cultivos celulares DPSC mostraron formas normales de MSC en las BGS. Las células de los BGS aloplásticos (d – g), alogénicos (h – k) y xenogénicos (l – o) mostraron una expansión normal y una morfología en forma de huso, primero con EV y segundo en ausencia de EV. Las células se orientaron a lo largo de la superficie de los injertos y crecieron en regiones aleatorias.

La viabilidad de DPSC se evaluó con y sin estimulación mediante nanopartículas de EV en diferentes BGS utilizando un ensayo de calceína AM. La Tabla 1 y la Fig. 3 muestran la medición de la proliferación y unión celular mediante la fluorescencia de la calceína en los días 3 y 7. El número de células positivas para calceína AM (en adelante CAM+) aumentó del día 3 al día 7 en todos los grupos. Además, para ambos puntos temporales, las DPSC con presencia de EV dieron como resultado significativamente más células CAM+ (p <0,001). Con aproximadamente 773,25 ± 5,95 células CAM+/mm2, las células CAM+ más abundantes (p < 0,001) se detectaron a los 7 días en las DPSC y EV en las BGS xenogénicas, en comparación con las BGS aloplásticas (con 501,38 ± 6,86 células CAM+/mm2 ) y BGS alogénicos (con 512,88 ± 15,45 células CAM+/mm2).

Medición de la proliferación y unión celular mediante tinción con Calceína AM; (a, b) después de 3 días de cultivo celular. (c, d) después de 7 días de cultivo celular. aumento de 50 ×; ***p < 0,001.

Luego probamos la viabilidad de DPSC bajo la influencia de EV cultivados durante 1, 3, 5 y 7 días en medio osteogénico en BGS aloplásticos, alogénicos y xenogénicos (Fig. 4). En todos los períodos de observación, se observaron muy pocas células muertas en el ensayo vivo/muerto, que no aumentaron de manera análoga con el creciente número de células vivas. Para el número significativamente mayor de 959 ± 11,81 células vivas por mm2, el grupo xenogénico tenía 18,00 ± 1,69 células muertas por mm2 después de 7 días. En los cuatro momentos, no se observaron diferencias significativas en el número de células muertas por mm2 entre todos los grupos.

Ilustración gráfica de la evaluación de vida o muerte de DPSC + EV después de (a) 1, (b) 3, (c) 5 y (d) 7 días. ***(p<0,001); *(p<0,05). ( e – f ) Imágenes de fluorescencia de tinción de muertos vivos de DPSC + EV después de 7 días. Imagen izquierda 50 × aumento; Imagen derecha 100 × aumento.

En las DPSC, la actividad de ALP se determinó después de un tratamiento de 7 y 14 días con EV y sin estimulación con EV como indicador temprano de la diferenciación celular hacia el linaje osteogénico. En comparación con DPSC sin EV, los EV aumentaron significativamente (p <0,001) la actividad de ALP en todos los BGS después de 7 días de cultivo (Tabla 2 y Fig. 5a, b). La proporción más alta del 40,85 ± 5,63% del área ALP+ se encontró en DPSC-EV cultivados en BGS xenogénico. Después de 14 días, todos los grupos de vehículos eléctricos mostraron un aumento significativo en la actividad de ALP en comparación con las DPSC sin vehículos eléctricos. Nuevamente, las DPSC en el andamio xenogénico mostraron la mayor actividad de ALP en el grupo sin EV, con un área de ALP+ de 39,81 ± 2,88 % (p < 0,001), y también en el grupo de DPSC + EV, con un área de ALP+ de 44,85 ± 1,25 %. , que fue significativamente mayor (p <0,001) que el injerto aloplástico DPSC + EV, con un área ALP+ de 31,83 ± 2,50% (Tabla 2 y Fig. 6a, b). Se realizaron tinciones con rojo de alizarina (ARS) y tinción de Von Kossa para evaluar la fase tardía de la diferenciación osteogénica después de 14 días. De manera análoga a la tinción con ALP, también se encontró un área ARS+ significativamente mayor bajo la influencia de EV en todos los materiales BGS. Este efecto fue particularmente evidente en material BGS xenogénico. Sin EV, el área ARS+ fue de 13,04 ± 1,02%, y con EV el porcentaje aumentó significativamente (p <0,001) a un área ARS+ de 34,53 ± 1,22% (Tabla 2 y Fig. 7a,b).

(a) Imágenes de tinción con ALP después de 7 días. 100 × Ampliación. (b) Representación gráfica de la evaluación de APL después de 7 días. ***(p<0,001); *(p<0,05).

(a) Imágenes de tinción con ALP después de 14 días. 100 × Ampliación. (b) Representación gráfica de la evaluación de APL después de 14 días. ***(p<0,001); *(p<0,05).

(a) Imágenes de tinción con ARS después de 14 días. 100 × Ampliación. (b) Representación gráfica de la evaluación del ARS después de 14 días. ***(p<0,001); *(p<0,05).

El potencial terapéutico de los vehículos eléctricos derivados de MSC ya se ha informado ampliamente9,12,15,23,25,28,31. Tanto los estudios in vivo como los in vitro han demostrado suficientemente que muchos factores clave de la remodelación ósea están controlados bajo la acción reguladora de los vehículos eléctricos derivados de MSC9,19,23,25.

En este estudio, nos centramos en las MSC aisladas del tejido de la pulpa dental. Se extrajeron las EV de DPSC humanas y comparamos la interacción y la diferenciación osteogénica de las DPSC humanas bajo la influencia de las EV en diferentes estructuras óseas para comprender mejor el papel de las EV derivadas de las DPSC, por un lado, y la influencia de diferentes sustitutos óseos en los efectos terapéuticos de las DPSC, por el otro. Todos los andamios pudieron transportar DPSC y todos los DPSC que probamos pudieron incorporar los vehículos eléctricos agregados in vitro. Durante el examen TEM, las DPSC en andamios aloplásticos, alogénicos y xenogénicos con y sin EV mostraron una forma normal y no se observaron diferencias morfológicas. Asimismo, las DPSC monocultivadas con EV mostraron una distribución homogénea de fibras de actina y extensión de filamentos en todos los materiales sustitutos óseos utilizados en el estudio.

La capacidad general de las DPSC para internalizar los vehículos eléctricos fue un aspecto importante de este estudio, lo que sugiere que la absorción de los vehículos eléctricos está relacionada con los efectos observados de las DPSC. Muchos estudios ya han explorado adecuadamente los miARN25, las proteínas de superficie y las glicoproteínas, así como las vías celulares específicas de internalización de EV32. Estaba más allá del alcance de este estudio determinar la eficiencia de la internalización de nuestros vehículos eléctricos o identificar y confirmar experimentalmente los miARN individuales, las proteínas de superficie y las glicoproteínas de las vías de absorción específicas de las células en la superficie de los vehículos eléctricos. Nuestro estudio se centró principalmente en la adopción cualitativa de los vehículos eléctricos extraídos en las DPSC. Otros investigadores ya han realizado investigaciones cualitativas sobre si los vehículos eléctricos pueden internalizarse en las células diana25,32. Durante 8 h, observamos una internalización y acumulación constante de EV marcados con WGA fluorescente en los DPSC con núcleos teñidos con DAPI a través de CLSM en nuestros experimentos. Teniendo en cuenta los resultados de los experimentos de proliferación y diferenciación, podemos suponer que los vehículos eléctricos se internalizaron de manera suficientemente eficiente en las DPSC.

Según Mondal et al.32, el aislamiento de los vehículos eléctricos es un paso importante para la investigación de estas vesículas. Aunque investigaciones anteriores han descrito desventajas como el mayor tiempo y la posible contaminación de proteínas requerida para la purificación de vehículos eléctricos mediante ultracentrifugación32, no observamos una fuerte contaminación por proteínas no vesiculares en nuestros estudios de nanoseguimiento o en el examen SEM. La heterogeneidad de los tamaños de los vehículos eléctricos es un fenómeno natural basado en diversos mecanismos de señalización intercelular de las células33. Estudios anteriores han descrito los tamaños heterogéneos de los vehículos eléctricos entre 30 y 200 nm9,25,32. De acuerdo con este trabajo anterior, en nuestro estudio se determinaron vehículos eléctricos en el rango de tamaño de aproximadamente 184,9 ± 67,0 nm mediante análisis de nanoseguimiento. La evaluación morfológica de los vehículos eléctricos mediante examen SEM también mostró que los vehículos eléctricos aislados eran idénticos en su forma morfológica, a pesar de sus tamaños heterogéneos.

El tratamiento de los defectos óseos craneofaciales34 y un suministro óseo insuficiente de la mandíbula plantean grandes desafíos para los terapeutas3,35. Aunque los sustitutos óseos puros son superiores al hueso autólogo en términos de morbilidad por extracción36, tienen deficiencias significativas en términos de osteogénesis, osteoinducción y osteoconducción3. Por tanto, se está llevando a cabo una búsqueda rigurosa de métodos alternativos para mejorar las propiedades osteogénicas de los BGS3,7,35,37. Re et al.13 describieron una mejor regeneración ósea de sustitutos óseos cuando se agregaron MSC y EV derivados a las estructuras. Nuestras investigaciones de DPSC se realizaron en injertos óseos aloplásticos, alogénicos y xenogénicos y, según los hallazgos de Re et al. 13, todos los soportes examinados en el presente estudio eran capaces de soportar DPSC y la influencia de los EV resultó en una mayor inducción. de diferenciación osteoblástica. Sin embargo, se observaron diferencias significativas en la cantidad de proliferación celular, unión celular y diferenciación osteogénica bajo la influencia de los EV, así como en la dependencia de los BGS.

La tinción con calceína AM, que indica actividad esterasa intracelular, es un método establecido para evaluar la viabilidad de las DPSC31,35. En nuestra experimentación, demostramos que las DPSC bajo la influencia de EV cultivadas en soportes xenogénicos durante 3 y 7 días, respectivamente, exhibieron números significativamente mayores de DPSC unidas y proliferadas, con hasta 773,25 ± 5,95 células CAM+/mm2 (p < 0,001). en comparación con todos los demás grupos. Esta observación es consistente con el trabajo de Zhang et al.31, quienes describieron en un estudio in vivo un mayor número de MSC calceína positivas en presencia de EV utilizados con material óseo xenogénico con una concentración de EV de 1 × 1012 nanopartículas/ml. versus una disminución significativa del hueso positivo a calceína en ausencia de vehículos eléctricos. Utilizamos una menor cantidad de vehículos eléctricos en nuestro estudio (2 × 109 nanopartículas/ml), pero a pesar de esta menor concentración de vehículos eléctricos, observamos un efecto altamente significativo (p <0,001) sobre la viabilidad celular de las DPSC bajo la estimulación de vehículos eléctricos. Mientras que en el ensayo de vida/muerte el número de DPSC vivas con EV en el andamio xenogénico (959 ± 11,81 células vivas/mm2) fue significativamente mayor (p < 0,001) en comparación con todos los demás grupos, no se observó ninguna diferencia con un 1,88% de células muertas en comparación con el porcentaje de células muertas con el andamio aloplástico (1,74%) y el andamio alogénico (2,28%), respectivamente. Considerados en conjunto, estos hallazgos indican que los vehículos eléctricos y los BGS xenogénicos favorecen la unión y proliferación de las DPSC, pero que no existe diferencia en la biocompatibilidad entre cada material y la influencia de los vehículos eléctricos.

Motamedian et al.29 informaron un efecto significativo de diferentes BGS en la diferenciación celular in vitro de DPSC. Mediante la evaluación de la diferenciación osteogénica mediante tinción con APL, este efecto se confirmó en nuestros estudios. En comparación con el andamio aloplástico, el cultivo de DPSC en los BGS xenogénicos mostró una actividad de ALP significativamente mayor a los 7 días y a los 14 días, con un área de ALP+ de 9,96 ± 0,92 (p < 0,05) y un área de ALP+ de 39,81 ± 2,88 % (p < 0,001). ), respectivamente. En contraste con nuestros hallazgos, en la literatura se ha descrito un efecto favorable en la diferenciación de DPSC mediante aloinjerto óseo liofilizado29, mientras que los datos de nuestro estudio han demostrado que el material óseo xenogénico fue superior a los armazones aloplásticos y autógenos en términos de diferenciación osteogénica de DPSC. Este fenómeno posiblemente pueda explicarse por el uso de diferentes BGS entre los estudios, que se obtuvieron de manera diferente y variaron en composición química. Este proceso debe estandarizarse para la futura selección de un BGS apropiado en futuras investigaciones clínicas in vivo. En un estudio comparativo, se determinó un aumento significativo de la actividad de ALP después de 14 días en MSC bajo la influencia de VE en comparación con el tratamiento con un medio osteogénico in vitro25. De manera análoga, se observó un aumento del 5,04 % en la actividad de ALP en el grupo DPSC en el BGS xenogénico bajo la influencia de EV, mostrando la diferenciación osteogénica más fuerte entre todos los grupos de andamios después de un período de observación de 14 días.

En el contexto de los defectos óseos y las enfermedades osteoporóticas, debido a que los investigadores se han centrado principalmente en la utilización de EV de MSC de la médula ósea y su contenido biológicamente activo31,38, el campo carece de conocimiento sobre el uso de DPSC como fuentes celulares alternativas para obtener EV que Tienen el potencial osteogénico para mejorar la formación de minerales óseos. Pero los vehículos eléctricos también tienen el potencial de mejorar la diferenciación de las células madre, ya que pueden acelerar la deposición de minerales óseos, entre otras aplicaciones9,31,39. Zhang et al.31 han descrito un mayor porcentaje de células ARS+ en hueso xenogénico en presencia de VE después de 8 semanas de curación ósea. De acuerdo con sus hallazgos, nuestros datos han demostrado un aumento significativo de células ARS+ por la presencia de vehículos eléctricos en todos los grupos después de 21 días. En comparación con todos los andamios con y sin intervención de EV, los DPSC-EV cultivados en el andamio xenogénico demostraron una diferenciación osteogénica significativamente mayor en la fase tardía, con un aumento del 21,45 % de células ARS+.

Dentro de las limitaciones de un estudio in vitro, los datos del presente trabajo muestran que el efecto de las vesículas extracelulares (EV) sobre la proliferación celular, la unión celular y la diferenciación osteogénica de las células madre de la pulpa dental (DPSC) cultivadas en andamios xenogénicos es significativamente superior. al de otros injertos óseos (BGS). La facilidad de obtener DPSC y el método de aislamiento confiable de los EV, combinados con las tasas de diferenciación osteogénica sinérgica, demuestran su idoneidad para futuros estudios de ingeniería de tejido óseo. En futuros estudios en organismos vivos en forma de experimentos con animales se deberían realizar más investigaciones sobre los resultados de este estudio sobre los sustitutos óseos correspondientes, así como sobre las propiedades osteogénicas de las DPSC bajo la influencia de los vehículos eléctricos sobre la regeneración ósea.

Todos los datos generados para este estudio están disponibles a través de los autores correspondientes previa solicitud razonable.

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Los autores agradecen el uso del equipo y las instalaciones del interdisciplinario. Centro de Investigación Clínica de la Facultad de Medicina de la Universidad RWTH Aachen. Nos gustaría agradecer a botiss biomaterials (botiss biomaterials GmbH, Alemania) por proporcionar los injertos óseos de forma gratuita.

Financiamiento de Acceso Abierto habilitado y organizado por Projekt DEAL. Con el apoyo de una subvención del Centro Interdisciplinario de Investigación Clínica de la Facultad de Medicina de la Universidad RWTH Aachen (OC1-8).

Departamento de Cirugía Oral y Maxilofacial, Hospital Universitario de RWTH Aachen, Pauwelsstraße 30, 52074, Aquisgrán, Alemania

Marius Heitzer, Philipp Winnand, Frank Hölzle y Ali Modabber

Departamento de Ortopedia, Traumatología y Cirugía Reconstructiva, Hospital Universitario de RWTH Aachen, Pauwelsstraße 30, 52074, Aachen, NRW, Alemania

Qun Zhao, Johannes Greven, Xing Zhang, Felix Marius Bläsius y Frank Hildebrand

Instituto de Patología, Hospital Universitario de RWTH Aachen, Pauwelsstraße 30, 52074, Aachen, NRW, Alemania

Eva Miriam Buhl y Sabine Neuss

Departamento de Ortodoncia, Hospital Universitario de RWTH Aachen, Pauwelsstraße 30, 52074, Aachen, NRW, Alemania

miguel lobo

BioInterface Group, Instituto Helmholtz de Ingeniería Biomédica, Universidad RWTH Aachen, Pauwelsstraße 20, 52074, Aachen, NRW, Alemania

Sabina Neuss

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MH: concepción y diseño, realización de los experimentos, adquisición de datos, análisis e interpretación, redacción del trabajo, aprobación final; QZ: realización de experimentos in vitro, adquisición de datos, revisión del trabajo, aprobación final; JG: concepción y diseño, análisis e interpretación, aprobación final; PW: adquisición de datos, revisión del trabajo, aprobación final; XZ: realización de experimentos in vitro, adquisición de datos, revisión del trabajo, aprobación final; FMB: concepción y diseño, revisión de la obra, aprobación final; EMB: análisis e interpretación, revisión del trabajo, aprobación final; MW: concepción y diseño, análisis e interpretación, redacción de la obra, aprobación final; SN: análisis e interpretación, revisión del trabajo, aprobación final; F.Hi.: concepción y diseño, análisis e interpretación, revisión del trabajo, aprobación final; F.Ho.: concepción y diseño, revisión de la obra, aprobación final; AM: concepción y diseño, análisis e interpretación, revisión del trabajo, aprobación final; y todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Qun Zhao.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Heitzer, M., Zhao, Q., Greven, J. et al. Evaluación de la biocompatibilidad in vitro de células madre de pulpa humana con injertos alogénicos, aloplásticos y xenogénicos bajo la influencia de vesículas extracelulares. Informe científico 13, 12475 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-39410-0

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Recibido: 26 de mayo de 2023

Aceptado: 25 de julio de 2023

Publicado: 01 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-39410-0

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