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Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 4104 (2023) Citar este artículo

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La resistencia bacteriana a los antibióticos es un importante problema de salud mundial. Durante las últimas décadas se han puesto a disposición muy pocos agentes y terapias antimicrobianos novedosos para uso clínico, a pesar de una necesidad cada vez mayor. Se han estudiado intensamente los péptidos antimicrobianos, muchos de los cuales han demostrado ser muy prometedores in vitro. Anteriormente hemos demostrado que la bacteriocina Plantaricina NC8 αβ (PLNC8 αβ) de Lactobacillus plantarum inhibe eficazmente Staphylococcus spp. Y muestra poca o ninguna citotoxicidad hacia los queratinocitos humanos. Sin embargo, debido a sus limitaciones en la inhibición de especies gramnegativas, el objetivo del presente estudio fue identificar nuevos compuestos peptidomiméticos antimicrobianos con un espectro de actividad mejorado, derivados del péptido β de PLNC8 αβ. Hemos diseñado y sintetizado racionalmente una pequeña biblioteca de lipopéptidos con actividad antimicrobiana significativamente mejorada contra bacterias grampositivas y gramnegativas, incluidos los patógenos ESKAPE. Los lipopéptidos constan de 16 aminoácidos con una cadena de ácido graso terminal y se ensamblan en micelas que inhiben y matan eficazmente las bacterias al permeabilizar sus membranas celulares. Demuestran una baja actividad hemolítica y los sistemas modelo de liposomas confirman aún más la selectividad por las membranas lipídicas bacterianas. La combinación de lipopéptidos con diferentes antibióticos potenció los efectos de forma sinérgica o aditiva. Nuestros datos sugieren que los nuevos lipopéptidos son prometedores como futuros agentes antimicrobianos; sin embargo, se necesitan experimentos adicionales utilizando modelos animales relevantes para validar aún más su eficacia in vivo.

Los antibióticos son el tratamiento más eficaz contra las infecciones bacterianas tanto de especies grampositivas como de gramnegativas. Muchas especies son patógenos oportunistas que pueden causar infecciones graves en humanos en relación con heridas crónicas y dispositivos médicos, por ejemplo, catéteres e implantes protésicos1. Estas acumulaciones bacterianas son la base de infecciones persistentes y generalmente difíciles de tratar, lo que aumenta el riesgo de diseminación bacteriana y desarrollo de complicaciones sistémicas2,3. Además, considerando el aumento gradual de la resistencia a los antibióticos, el tratamiento puede ser aún más difícil de lograr ya que las opciones disponibles son cada vez más limitadas4. En consecuencia, se necesitan con urgencia nuevos enfoques y tratamientos alternativos innovadores contra las infecciones bacterianas. Los péptidos antimicrobianos (AMP) representan una de las clases más prometedoras de sustancias antimicrobianas y una rica fuente para el desarrollo de nuevas terapias altamente potentes5,6.

Dado que los antibióticos son cada vez menos eficaces, los AMP se han convertido en candidatos atractivos en la medicina humana debido a sus propiedades antimicrobianas. Muchos AMP muestran baja toxicidad para las células eucariotas y actividad contra bacterias patógenas que han adquirido resistencia a los antibióticos5,7. Estos péptidos generalmente constan de secuencias cortas (<100 aminoácidos) sin una estructura secundaria ordenada cuando están en solución. Por lo general, son muy termoestables, toleran cambios de pH y expresan actividad bactericida contra una amplia gama de microbios8,9,10,11. Las bacteriocinas son un grupo heterogéneo de AMP producidos por varias bacterias diferentes. Pueden ser tanto de espectro estrecho como amplio, y varias bacteriocinas exhiben una potente actividad antibacteriana y baja toxicidad para las células animales5. Anteriormente hemos demostrado que la bacteriocina PLNC8 αβ permeabiliza el patógeno oral gramnegativo Porphyromonas gingivalis e inhibe sus efectos citotóxicos e inmunomoduladores en las células humanas12,13. Además, recientemente hemos demostrado que PLNC8 αβ es más eficaz contra bacterias del género Staphylococcus, incluidas cepas que han adquirido resistencia a los antibióticos, y mejora varias veces la actividad de diferentes antibióticos14.

Las bacterias más problemáticas y causantes de enfermedades han sido categorizadas por la Organización Mundial de la Salud (OMS) y constituyen Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa y Enterobacter species (ESKAPE). Estas bacterias han desarrollado resistencia a múltiples medicamentos contra varias clases de antibióticos y pueden formar biopelículas. La OMS ha incluido los patógenos ESKAPE entre sus 12 patógenos prioritarios que necesitan urgentemente el desarrollo de nuevos antimicrobianos. La mayoría de los antibióticos recomendados en las directrices del Clinical & Laboratory Standards Institute para actuar contra los patógenos ESKAPE se han eliminado de las directrices y se han añadido muy pocos antibióticos novedosos o combinaciones de antibióticos en su lugar15. Dado que las infecciones causadas por los patógenos ESKAPE son las más problemáticas en humanos, es importante encontrar tratamientos alternativos que consistan en nuevos compuestos antimicrobianos. La potencia y la baja toxicidad de sustancias nuevas e innovadoras pueden reducir potencialmente el uso general de antibióticos y, en consecuencia, el desarrollo y la propagación de la resistencia a los antimicrobianos pueden suprimirse mediante el uso de AMP, solos o en combinación con dosis bajas de antibióticos.

Los AMP han sido intensamente estudiados durante décadas. Si bien numerosos compuestos han demostrado ser altamente efectivos in vitro, la mayoría ha mostrado limitaciones como la susceptibilidad a las proteasas y la inhibición de la actividad en presencia de sales o cationes o sometidos a cambios de pH, cuando se examinan en entornos más complejos16 ,17. Sin embargo, los avances en el campo de la ingeniería de fármacos y los peptidomiméticos antimicrobianos ahora permiten el diseño de miméticos de AMP con estabilidad de proteasa mejorada, menor toxicidad y mayor actividad antimicrobiana, proporcionando así medios para sortear estas limitaciones18,19.

A la luz de esto, hemos diseñado y llevado a cabo una optimización y caracterización cuidadosa y sistemática de una nueva clase de compuestos peptidomiméticos derivados de Plantaricin NC8β, con el objetivo de identificar nuevos compuestos antimicrobianos con baja toxicidad y actividad antimicrobiana mejorada hacia un espectro más amplio de especies bacterianas, con especial atención a futuras aplicaciones tópicas. Mostramos que varios de estos nuevos compuestos, compuestos por 16 aminoácidos con una cadena de ácido graso (FA) terminal corta, exhiben una actividad antibacteriana significativa y una baja actividad hemolítica para los eritrocitos humanos. Los lipopéptidos demuestran una mayor afinidad por las bicapas lipídicas que imitan las membranas bacterianas en comparación con las membranas celulares que imitan las de los mamíferos, lo que los convierte en candidatos interesantes para futuras investigaciones. Además, sugerimos que el enfoque de diseño sistemático desarrollado en este estudio permita el desarrollo de nuevos compuestos antimicrobianos, donde se pueden sortear varias de las limitaciones inherentes de los péptidos antimicrobianos.

S. aureus (ATCC 29213, MSSA, ATCC, Manassas, VA), E. coli (K-12 MG1655) y aislados clínicos de S. aureus, E. coli, E. faecium, K. pneumoniae, A. baumannii, P .aeruginosa y E. cloacae obtenidas del Departamento de Medicina de Laboratorio del Hospital Universitario de Örebro se sembraron en placas de agar Luria-Bertani (LB) y se incubaron a 37 °C durante la noche. Se inocularon colonias individuales en 5 ml de caldo LB y se incubaron en un agitador (400 rpm) a 37 °C durante la noche. Las concentraciones bacterianas se determinaron mediante recuento viable y se ajustaron para correlacionarse con aproximadamente 109 UFC/ml. Los patrones de resistencia para los aislados clínicos se pueden encontrar en la Tabla complementaria S1.

La secuencia de PLNC8 β de los dos péptidos bacteriocina PLNC8 αβ se utilizó para diseñar péptidos antimicrobianos nuevos y optimizados. La actividad antimicrobiana de los péptidos truncados y de longitud completa de PLNC8 β se predijo utilizando los servidores AntiBP20 y ADAM21. La secuencia con la puntuación más alta de actividad antimicrobiana prevista se utilizó para generar nuevas variantes. Las características de los péptidos, como el punto isoeléctrico, la carga neta a pH 7 y el porcentaje de residuos hidrófobos, ácidos, básicos y neutros, se determinaron utilizando Peptide 2.0 (Custom Peptide Synthesis (peptide2.com)). Se predijo una suposición teórica de la estructura del péptido utilizando la herramienta PEP-FOLD22,23 en el portal web RPBS24. Todas las secuencias que mostraban características de ser péptidos antimicrobianos se sintetizaron y probaron contra bacterias grampositivas (S. aureus) y gramnegativas (E. coli).

Todos los péptidos y lipopéptidos se sintetizaron utilizando química Fmoc en un sintetizador de péptidos de microondas automatizado (Liberty Blue, CEM) en una escala de 25 a 250 μM. Se utilizó resina ProTide Rinkamide (LL) como soporte sólido para todas las síntesis, produciendo un terminal C amidado. Los péptidos LL-37 y PLNC8 β con un ácido libre C-terminal se sintetizaron en una resina Cl-MPA ProTide (LL) usando KI anhidro (0,125 M) y DIEA (1 M) en DMF para unir el primer amino protegido con Fmoc. ácido (5 eq). La reacción se realizó dos veces durante 10 min a 90 °C usando condiciones de microondas. Para todos los péptidos, los aminoácidos protegidos con Fmoc se acoplaron secuencialmente usando un exceso de cinco veces de aminoácido, Oxyma como base y DIC como reactivo de acoplamiento en DMF en condiciones de microondas. La desprotección de Fmoc se logró mediante tratamiento con piperidina al 20% en DMF en condiciones de microondas. Después de la desprotección final de Fmoc, se logró la modificación N-terminal mediante el tratamiento del péptido unido a resina con anhídrido acético en DMF (1:1) para la acetilación, o ácidos n-alcanos (10 eq) combinados con HCTU (10 eq) y DIEA. (20 eq) en DMF para la lipidación. La desprotección global y la escisión de los péptidos de la resina se lograron mediante tratamiento con TFA:TIS:H2O (95/2,5/2,5, v/v/v) durante 3 h antes de concentrarlos usando una corriente de nitrógeno. Los péptidos brutos se precipitaron dos veces en éter dietílico enfriado con hielo y se descartó el éter. Los péptidos brutos se purificaron en un sistema HPLC semipreparativo (Dionex) equipado con una columna RP C-18 (ReproSil Gold) usando un gradiente acuoso de acetonitrilo que contenía TFA al 0,1%. La pureza se controló utilizando una columna analítica (C-18, Supelcosil) unida al mismo sistema de HPLC (Figura complementaria S1) y la identidad del péptido se confirmó utilizando un espectrómetro de masas Maldi-ToF (Bruker) (Figura complementaria S2).

Los liposomas se prepararon mediante el método de hidratación de película fina. Soluciones madre de lípidos (10 mg/ml en cloroformo, Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, Estados Unidos) de los lípidos 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC), 1-palmitoil-2 Se emplearon -oleoil-sn-glicero-3-fosfo-L-serina (POPS), 1-hexadecanoil-2-(9Z-octadecenoil)-sn-glicero-3-fosfoglicerol (POPG) y colesterol (Chol). Se prepararon liposomas bacterianos con una proporción de 75:25 de POPC:POPG y se prepararon liposomas de mamíferos con una proporción de 65:5:30 de POPC:POPS:Chol. Las soluciones de lípidos se homogeneizaron completamente y el disolvente se evaporó con el uso de vapor de N2 seco para producir una torta de lípidos. El secado completo se logró con una incubación durante la noche en un desecador de vacío. Posteriormente, la película lipídica se hidrató con una solución de 5 (6) -CF (CF 50 mM, PBS 10 mM, NaCl 90 mM, pH 7,4). Después de una incubación de 10 minutos en un agitador orbital (50 min-1), la solución se agitó durante 60 s a velocidad media. Se empleó una mini extrusora (Avanti Polar Lipids, Inc., Estados Unidos) y se realizaron 21 extrusiones a través de una membrana de filtro de 0,1 µm (membrana hidrófila grabada en pista Nuclepore, Cytiva, Whatman, MA, Estados Unidos), dando como resultado liposomas unilaminares monodispersos. . Directamente antes de su uso, los liposomas se purificaron a partir de CF no encapsulado mediante filtración a través de una columna de filtración en gel (columna PD Minitrap G-25, Cytiva, Estados Unidos), frente a tampón PBS (10 mM, pH 7,4).

La actividad de péptidos y lipopéptidos hacia modelos de liposomas se evaluó mediante un ensayo de liberación de carboxifluoresceína (CF). Los liposomas se diluyeron en PBS (10 mM, pH 7,4) hasta una concentración final de lípidos de 25 µM y se incubaron con péptidos (10–5–102 µM) en una placa de 96 pocillos (n = 3). La liberación de CF se controló utilizando un lector de placas Infinite M1000 PRO cada 2,5 minutos durante 1 h. La liberación completa (100%) de CF se obtuvo mediante la adición de una solución Triton X-100 al 1% seguida de una incubación de 10 minutos. El porcentaje de liberación de CF se evaluó según la fórmula 100 * (F - F0)/(FT - F0), donde F indica la fluorescencia instantánea, FT la fluorescencia total y F0 la fluorescencia de fondo antes de la adición del péptido. Los datos se ajustaron a una curva Hill-1 utilizando MATLAB R2019a (The MathWorks Inc., Natick, Massachusetts, Estados Unidos) y se extrajo la mitad de la concentración efectiva máxima (CE50).

Se utilizó espectroscopía de dicroísmo circular (CD) para determinar la estructura de los péptidos tras la interacción con las membranas lipídicas. Se utilizó un Chirascan (Applied Photophysics, Leatherhead, Reino Unido) y las mediciones se realizaron utilizando una cubeta de cuarzo con una trayectoria de luz de 1 mm a temperatura ambiente, en el rango de longitud de onda de 195 a 280 nm (en pasos de 0,5 nm). Se prepararon liposomas que imitaban membranas bacterianas (POPC:POPG 75:25) en tampón PBS (10 mM, pH 7,4) como se describió anteriormente. Los lipopéptidos L-6-C5 y L-6-C5-Leu se mezclaron con solución de liposomas y se incubaron durante 30 minutos. En todos los experimentos, la concentración de péptidos fue de 30 µM y la concentración de lípidos fue de 1,2 mM. Se registraron tres exploraciones para cada muestra y los resultados se corrigieron al inicio frente al tampón PBS (10 mM, pH 7,4). Las curvas se analizaron con MATLAB R2019a (The MathWorks, Inc., Natick, Massachusetts, Estados Unidos) y se suavizaron con un filtro Savitzky-Golay.

La agregación de lipopéptidos se evaluó en una plataforma ALV/CGS-8F (ALV-GmbH, Langen, Alemania) equipada con un láser He-Ne de 632,8 mm. La luz dispersada se recogió a 90°. Se eligió PBS (10 mM, pH 7,4) como tampón y se filtró con un filtro de 0,22 µm antes de su uso. Las muestras se prepararon en una cubeta de vidrio cilíndrica sumergida en tolueno con índice de refracción equivalente. Los péptidos se diluyeron en serie entre 100 µM y 0,01 nM, se sonicaron durante 1 min y se incubaron durante 5 min a 22 °C y se agitaron con vórtex antes de medir. La temperatura se controló durante todo el experimento mediante el uso de un baño de agua circulante. Los datos se analizaron con el software ALV-Correlator (Versión 3.0, ALV-GmbH, Langen, Alemania) y la intensidad de dispersión se obtuvo mediante un promedio de 10 carreras consecutivas de 30 s.

Se utilizó el método de microdilución en caldo para determinar la concentración mínima inhibidora (CMI) y la concentración mínima bactericida (CBM), de acuerdo con los estándares EUCAST para el método de microdilución en caldo. Se utilizaron diluciones en serie al doble de los lipopéptidos y las concentraciones finales oscilaron entre 0,19 y 100 µM. En resumen, se realizaron diluciones en serie al doble de los lipopéptidos en una placa de 96 pocillos en PBS, con un volumen final de 100 µl por pocillo, después de lo cual se añadieron 100 µl de medio caldo LB que contenía aproximadamente 5 × 105 UFC/ml de Se agregaron bacterias a cada pocillo. Luego la placa se incubó durante 20 h a 37 °C en un agitador (400 rpm). El efecto de las combinaciones de lipopéptidos y antibióticos se investigó mediante ensayos de tablero de ajedrez. Los ensayos se realizaron de acuerdo con las pruebas MIC y MBC realizadas anteriormente, pero con diluciones en serie dobles horizontales y longitudinales de los compuestos probados. Las concentraciones finales de los antibióticos vancomicina, tetraciclina, ciprofloxacino y rifampicina oscilaron entre 0,031 y 8 µg/ml (S. aureus), mientras que para E. coli, gentamicina, cefotaxima y ciprofloxacino oscilaron entre 0,0078 y 4 µg/ml y rifampicina osciló entre 0,0078 y 4 µg/ml (S. aureus). entre 0,78 y 100 µg/ml. Todos los valores de MIC se determinaron visual y espectroscópicamente (620 nm) como la primera concentración que inhibió completamente el crecimiento bacteriano. Todos los valores de MBC se determinaron cultivando gotas de 10 µl de todas las concentraciones que dieron como resultado una inhibición completa del crecimiento bacteriano en placas de agar LB, y la concentración más baja en la que no se observó crecimiento representó la MBC. La concentración inhibidora fraccionaria (FIC) y la concentración bactericida fraccionaria (FBC) se calcularon mediante la ecuación (CMI o CMB de péptido en combinación/CMI o CMB de péptido solo) + (CIM o CMB de antibiótico en combinación/CIM o CMB de antibiótico solo). La sinergia se definió como FIC/FBC ≤ 0,5, aditiva cuando 0,5 < FIC/FBC ≤ 1, indiferente cuando 1 < FIC/FBC < 2 y antagonista cuando FIC/FBC ≥ 2. Todos los experimentos se repitieron al menos tres veces.

Para evaluar el riesgo de desarrollo de resistencia al lipopéptido, se realizó un ensayo de pases en serie. En resumen, se cultivaron S. aureus y E. coli en presencia de concentraciones sub-MIC (1 µM) de L-6-C5 durante 30 pases. Se determinaron MIC y MBC para los pases 0, 10, 20 y 30, utilizando el método de microdilución en caldo y se compararon con las bacterias no expuestas (pase 0).

La actividad hemolítica de los lipopéptidos se investigó recogiendo sangre de voluntarios sanos en vacutainers heparinizados. Brevemente, la sangre se centrifugó a 600 x g durante 5 minutos y el sedimento de eritrocitos se lavó tres veces en PBS. Luego, las células se suspendieron en PBS y se agregaron a placas de 96 pocillos (suspensión de eritrocitos al 15 %/pocillo), que contenían los lipopéptidos con una dilución en serie al doble. Las placas se incubaron durante 1 h a 37 °C, seguido de centrifugación durante 5 min a 900 xg y medición de la absorbancia de los sobrenadantes a 540 nm. La actividad hemolítica (%) se calculó restando el control negativo de todos los valores y la normalización frente al control positivo (Triton X-100 al 0,5%), que se estableció en 100%. Todos los experimentos, cada uno por duplicado, se repitieron tres veces.

Para investigar la permeabilización de la membrana causada por los lipopéptidos se utilizó el colorante fluorescente Sytox® Green. Este fluoróforo sólo puede atravesar membranas dañadas y emitir fluorescencia al unirse a ácidos nucleicos. Las bacterias se lavaron y resuspendieron en PBS y se incubaron durante 5 minutos con o sin péptidos en placas de microtitulación de 96 pocillos. Las imágenes fueron capturadas con Olympus BX41.

La junta ética regional del condado de Örebro-Uppsala aprobó el permiso ético para recolectar sangre heparinizada de voluntarios sanos (Dnr 2015/543). Se obtuvo el consentimiento informado de todos los voluntarios. La extracción de sangre y los métodos asociados se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices y regulaciones pertinentes.

Si bien los AMP son heterogéneos en cuanto a la longitud de sus residuos, la mayoría de los AMP catiónicos naturales normalmente constan de 12 a 100 aminoácidos25. Sin embargo, se ha demostrado que varios AMP catiónicos sintéticos son eficientes con un número de residuos <10, lo que puede ayudar a resolver parte de las limitaciones inherentes de varios AMP, a saber, su tamaño voluminoso y su alto costo de síntesis26. Lata y sus colegas20, los desarrolladores del servidor AntiBP, utilizado para parte de nuestras predicciones, concluyeron que los péptidos compuestos por 15 aminoácidos eran óptimos al usar su servidor. En la Fig. 1 se muestra una descripción general del proceso que se describe a continuación. Al tener en cuenta los puntos anteriores, con el objetivo de diseñar AMP lo más cortos y efectivos posible, la secuencia de PLNC8 β se truncó a 16 aminoácidos (residuo #1 –16), después de lo cual se eliminó un aminoácido de la región N-terminal y se agregó un aminoácido a la región C-terminal. Esto se completó a lo largo de toda la secuencia de PLNC8 β, que está compuesta por 34 aminoácidos, y se generó una pequeña biblioteca de 19 secuencias peptídicas diferentes, cada una de las cuales consta de 16 aminoácidos. Estas secuencias luego se analizaron en los servidores AntiBP20 y ADAM21 para predecir la actividad antimicrobiana en función de la composición/patrón de aminoácidos y la relación secuencia-estructura, respectivamente. Se predijo que diez de las secuencias serían péptidos antimicrobianos. Además, se eligió el péptido con la puntuación general más alta de las secuencias truncadas para la sustitución de residuos y se evaluó de manera similar para determinar la actividad antimicrobiana prevista, generando una biblioteca de 24 secuencias con actividad antimicrobiana prevista (Tabla 1).

Descripción general de la estrategia de diseño de los lipopéptidos. Esquemas del proceso de truncamiento y mutación del péptido PLNC8 β (secuencia escrita en la parte superior). El cuadro verde claro indica aminoácidos en forma L, el cuadro verde oscuro indica aminoácidos en forma D y el cuadro gris indica átomos de carbono. El cuadro resaltado en amarillo indica una actividad antimicrobiana alta prevista.

Las 15 secuencias peptídicas con mayor puntuación de esta biblioteca se sintetizaron con un N-terminal acetilado y un C-terminal amidado. Se exploraron las actividades antimicrobianas de estos 15 péptidos contra S. aureus y E. coli. Si bien se predijo que las 15 secuencias tenían actividad antimicrobiana, solo el péptido 6 mostró actividad inhibidora y bactericida real in vitro contra ambas bacterias con una CIM y MBC de 100 µM para S. aureus y 50 µM para E. coli (Tabla 2). La actividad antimicrobiana del péptido 6 contra E. coli fue comparable a la actividad de LL-37, mientras que PLNC8 β de longitud completa no mostró actividad. El péptido 18 mostró actividad bacteriostática contra E. coli a una concentración final de 100 µM, sin mostrar actividad bactericida alguna.

Dado que el péptido 6 mostró actividad antibacteriana in vitro tanto para S. aureus como para E. coli, se realizaron modificaciones adicionales para mejorar su estabilidad frente a la degradación proteolítica y su actividad antimicrobiana, incluida la conjugación de FA y la PEGilación de la región N-terminal. Se ha demostrado que la conjugación de una fracción hidrófoba, como un FA, con péptidos antimicrobianos modula su actividad y selectividad. Dependiendo del péptido y de las propiedades de la fracción conjugada, este tipo de modificación puede ser beneficiosa o perjudicial, por ejemplo, afectando la actividad antimicrobiana y la selectividad de las membranas bacterianas sobre las células eucariotas27. La PEGilación se utiliza en varios productos farmacológicos, principalmente para mejorar la vida media del fármaco al prevenir la degradación proteolítica, pero también puede tener otros efectos beneficiosos, como reducir el reconocimiento por parte del sistema inmunológico28. La PEGilación no mejoró la actividad antimicrobiana del péptido 6, pero, por el contrario, la conjugación de una cadena de FA aumentó notablemente la actividad antimicrobiana (Tabla 3). En comparación con 6, los valores de MIC y MBC disminuyeron proporcionalmente a la longitud de la cadena del FA, con un óptimo observado en cinco a siete átomos de carbono (L-6-C5, L-6-C6 y L-6-C7). El aumento de la longitud de la cadena FA a ocho átomos de carbono (L-6-C8) no aumentó aún más la actividad antimicrobiana contra S. aureus, mientras que se observó una disminución en la actividad contra E. coli con un aumento en los valores de MIC y MBC de 6,2 µM a 12,5. µM, respectivamente. Una cadena FA de ≥ 10 átomos de carbono redujo drásticamente la inhibición bacteriana y abolió por completo los efectos bactericidas. Además, los enantiómeros D de 6-C5, 6-C6 y 6-C7 mostraron una mayor actividad antimicrobiana contra S. aureus y E. coli. Para promover aún más el plegamiento de los lipopéptidos, una modificación adicional de L/D-6-C5, L/D-6-C6 y L/D-6-C7 incluyó la sustitución de los tres residuos de isoleucina (Ile) por leucina (Leu). . Leu tiene una mayor propensión a la hélice α que Ile, lo que planteamos la hipótesis de que podría aumentar aún más la actividad de membrana de los lipopéptidos. Curiosamente, la sustitución de los tres residuos de Ile con Leu contra S. aureus redujo la MIC y MBC contra S. aureus en aproximadamente un 50% en comparación con las variantes que contienen Ile. La microscopía de fluorescencia utilizando un ensayo SYTOX Green mostró que el efecto lítico de membrana de todos los lipopéptidos fue rápido, con una lisis bacteriana sustancial ya después de 5 minutos de manera dosis dependiente (Fig. 2). Se observó una lisis más pronunciada para los lipopéptidos modificados con cadenas FA de cinco a siete carbonos en comparación con aquellos con dos u ocho carbonos.

Permeabilización de membranas bacterianas. La absorción de Sytox Green por (A) S. aureus y (B) E. coli se determinó después de la exposición a diferentes concentraciones de péptidos acetilados en PBS durante 5 minutos, la barra de escala es de 200 µm. La conjugación del péptido con una cadena FA de cinco a ocho átomos de carbono es eficaz para permeabilizar las membranas bacterianas tanto grampositivas como gramnegativas. El enantiómero D y la variante de leucina de 6-C5 fueron igualmente potentes que la forma L para permeabilizar S. aureus y E. coli.

Para evaluar más a fondo la actividad del lipopéptido, se determinó la MIC y MBC de los compuestos principales (L/D-6-C5 y L/D-6-C5-Leu) para cepas adicionales de S. aureus y E. coli. Se obtuvieron 18 cepas aisladas clínicas de S. aureus y 18 cepas aisladas clínicas de E. coli del Departamento de Medicina de Laboratorio del Hospital Universitario de Örebro. De las cepas de S. aureus, nueve cepas fueron identificadas como MSSA y nueve como MRSA. Para E. coli, se identificaron ocho cepas como cepas de BLEE y las 10 cepas de E. coli restantes no mostraron resistencia a los antibióticos o solo mostraron una resistencia menor (Tabla complementaria S1). Además de S. aureus y E. coli, se llevaron a cabo pruebas de susceptibilidad para L/D-6-C5 y L/D-6-C5-Leu para aislados clínicos de los patógenos ESKAPE restantes (E. faecium, K. pneumoniae , A. baumannii, P. aeruginosa y E. cloacae). Todas las cepas analizadas, a excepción de E. cloacae, fueron susceptibles a todas las variantes C5. E. cloacae, aunque susceptible a los enantiómeros D de 6-C5 y 6-C5-Leu, no fue inhibida completamente por los enantiómeros L, aunque se pudo observar cierta inhibición. La MIC y MBC de estas bacterias se muestran en la Tabla 4.

La citotoxicidad y la actividad hemolítica de los AMP sintéticos han sido problemáticas y es un aspecto importante que debe evaluarse cuidadosamente. Se encontró que la actividad hemolítica estaba asociada con la longitud de la cadena FA (Fig. 3A). Los lipopéptidos con una longitud de cadena FA con ≤ 6 átomos de carbono causaron menos del 5% de hemólisis a 100 µM después de 1 h de incubación con eritrocitos en PBS a 37 °C. Los lipopéptidos con cadenas FA con 7 a 10 átomos de carbono causaron alrededor del 10% de hemólisis. Aumentar la longitud de la cadena FA a 15 átomos de carbono aumentó la hemólisis al 40%. Los enantiómeros L de 6-C5, 6-C6 y 6-C7 mostraron una mayor actividad hemolítica que el enantiómero D correspondiente, alcanzando ~ 10%. Se observó un aumento adicional en la actividad hemolítica para las variantes que contienen Leu (Fig. 3B). Los enantiómeros D de 6-C5, 6-C6 y 6-C7 mostraron una actividad hemolítica similar a la de las formas L (Fig. 3C). La actividad hemolítica a 100 µM en relación con la longitud de la cadena FA se muestra en la Fig. 3D.

Actividad hemolítica de péptidos modificados y de longitud completa de PLNC8 β. La actividad hemolítica se determinó en eritrocitos humanos (15% suspendidos en PBS) después de (A) exposición a los péptidos con diferentes longitudes de cadenas FA usando las concentraciones indicadas durante 1 h. La actividad hemolítica se asoció con la longitud de la cadena de FA, donde la conjugación de una cadena larga de FA (≥ 7 átomos de carbono) hizo que los péptidos fueran más hemolíticos. Actividad hemolítica de los enantiómeros L (B) y D-enantiómero (C) de 6-C (5–7) de las variantes de isoleucina y leucina. La sustitución de los tres residuos de isoleucina por leucina hizo que el lipopéptido fuera más hemolítico. (D) Actividad hemolítica a 100 µM con respecto a la longitud de la cadena FA.

La actividad de membrana de los lipopéptidos se confirmó además utilizando modelos de liposomas con composiciones de lípidos que imitan a procariotas o eucariotas. La capacidad de los lipopéptidos para perturbar la integridad de la membrana lipídica se investigó monitoreando la liberación del colorante fluorescente carboxifluoresceína (CF) encapsulado en los liposomas en concentraciones de autoextinción (Figura complementaria S3). Se observó que la permeabilización de liposomas que imitan bacterias tiene lugar a una concentración de lipopéptidos <1 µM para todas las secuencias con una longitud de cadena FA de ocho o menos átomos de carbono (Figura complementaria S3A). El aumento de la longitud de la cadena FA resultó en una disminución de la actividad de la membrana (Figura complementaria S3B). Se utilizaron PLNC8 β de longitud completa y el péptido antimicrobiano de origen humano LL-37 como controles (Figura complementaria S3F). La liberación de CF fue más lenta para los lipopéptidos en comparación con el PLNC8 β de longitud completa. Este último mostró permeabilización de las membranas de los liposomas incluso en concentraciones tan bajas como 100 pM, lo que resultó en una liberación de ~ 20% de CF después de 60 minutos de incubación (Figura complementaria S4). La actividad de membrana de LL-37 fue inferior a la de todos los lipopéptidos con una cadena FA con menos de ocho átomos de carbono (Tabla 5).

La actividad de la membrana se evaluó adicionalmente hacia liposomas que imitaban membranas lipídicas de mamíferos. Se midió que el efecto de permeabilización era aproximadamente de 10 a 100 veces mayor en comparación con los liposomas que imitan bacterias, lo que demuestra la idoneidad de estos lipopéptidos para su uso en la selección de bacterias (Tabla 5). La actividad de la membrana aumentó con la longitud de la cadena FA hasta 8 átomos de carbono, después de lo cual no se observó ningún aumento adicional (Figura complementaria S3G, H).

Independientemente de la composición de lípidos, los enantiómeros L y D de los lipopéptidos tenían una actividad de membrana y una cinética de liberación de CF similares (Figuras complementarias S3C – E, I – K, S4, S5). Sorprendentemente, la sustitución de leucina por isoleucina dio como resultado un ligero aumento en la actividad de la membrana en liposomas que imitan membranas lipídicas tanto bacterianas como de mamíferos, con el efecto más pronunciado en estos últimos (Tabla 5).

Dado que los lipopéptidos son anfipáticos, pueden ser propensos a autoensamblarse en estructuras supramoleculares más grandes, lo que podría influir en la actividad de la membrana. Empleamos dispersión dinámica de luz (DLS) para estudiar la agregación de lipopéptidos y la dependencia de la longitud de la cadena FA en su solubilidad, centrándonos en los péptidos L-6, L-6-C2, L-6-C5 y L-6-C7. El carácter anfifílico de los lipopéptidos determina su propensión a autoensamblarse en soluciones acuosas. Por tanto, podemos plantear la hipótesis de que los lipopéptidos forman estructuras similares a micelas que están en equilibrio dinámico con los monómeros de lipopéptidos disueltos. Por encima de la concentración crítica de agregación (CAC), se favorece la formación de agregados más grandes, a expensas de los lipopéptidos disueltos, lo que resulta en un aumento en la intensidad de dispersión en el DLS. La CAC de los lipopéptidos L-6, L-6-C2, L-6-C5 y L-6-C7 se estimó en 10, 8, 5,6 y 0,8 μM, respectivamente (Fig. 4B-F), destacando la correlación. entre la longitud de la cadena FA y la propensión a agregarse.

Caracterización de estructuras secundarias y determinación de concentración de agregación crítica (CAC). (A) Espectros de CD de péptidos L-6-C5 y L-6-C5-Leu 30 µM sin (línea de puntos) y con (línea completa) modelos de liposomas POPC:POPG (75:25) 1,2 mM en tampón PBS (10 mM, pH 7,4). Recuadro: análisis de la propensión de aminoácidos de las secuencias peptídicas (i) L-6-C5 y (ii) L-6-C5-Leu (con exclusión de la cola de ácido graso). (BE) Análisis DLS: intensidad de dispersión de lipopéptidos (B) L-6, (C) L-6-C2, (D) L-6-C5 y (E) L-6-C7 en PBS 10 mM (pH 7,4 ). (F) Relación entre la concentración de agregación crítica (CAC) y la longitud de la cadena de ácidos grasos de los lipopéptidos L-6, L-6-C2, L-6-C5 y L-6-C7.

Los AMP suelen ser espirales aleatorias en solución, pero se pliegan al interactuar con membranas bacterianas. La estructura secundaria de los lipopéptidos L-6-C5 y L-6-C5-Leu se evaluó mediante espectroscopia de dicroísmo circular (CD) (Fig. 4A) en ausencia y presencia de modelos de liposomas que imitan bacterias compuestos de POPC: POPG ( 75:25). Ambos lipopéptidos estaban predominantemente en espiral en solución en ausencia de membranas lipídicas. Sin embargo, observamos un cambio pronunciado en la estructura secundaria del lipopéptido cuando interactúa con los liposomas, lo que indica en parte la presencia de elementos de la estructura secundaria α-helicoidal. El lipopéptido L-6-C5 presenta una mezcla homogénea de aminoácidos con propensión tanto a la hélice a como a la cadena β, así como dos residuos rompedores de estructuras29, Gly y Ser en las posiciones 2 y 8, respectivamente. Por tanto, no se espera una estructura secundaria bien definida, ni en solución ni en interacción con membranas lipídicas. El intercambio de Ile por Leu en las posiciones 3, 5 y 16, que produce el lipopéptido L-6-C5-Leu, aumenta el número de aminoácidos con alta propensión a la hélice α de 7 a 10 (Fig. 4A, ii) 30. A pesar de tener una hidrofobicidad muy similar, Leu (0,21 kcal/mol) es un formador de hélices significativamente mejor que Ile (0,41 kcal/mol). Sin embargo, aunque esta modificación mejoró los valores de MIC y MBC, no se observaron cambios significativos en la estructura secundaria, probablemente debido a la agrupación de los residuos de leucina cerca del extremo N del péptido (Leu-Lys-Leu-Leu en la posición 3-6). ), que está flanqueado por Gly en la posición 2 y Ser en la posición 8, lo que desestabiliza la estructura helicoidal.

Una preocupación importante al desarrollar nuevos compuestos antibacterianos es el riesgo de desarrollo de resistencia. Tanto S. aureus como E. coli cultivadas en presencia de concentraciones sub-MIC de L-6-C5 durante 30 pases conservaron los mismos valores de MIC y MBC que las bacterias no expuestas (pase 0), lo que indica que no se desarrolló resistencia ( Tabla complementaria S2).

Los enantiómeros L y D del lipopéptido 6-C5 y los enantiómeros L y D de las variantes de 6-C5-Leu con isoleucina sustituida por leucina se combinaron con diferentes antibióticos y se determinó la actividad antimicrobiana contra E. coli y S. aureus. Los lipopéptidos pudieron disminuir las concentraciones de antibióticos requeridas para inhibir y matar las bacterias de manera aditiva o sinérgica en la mayoría de las combinaciones probadas, aunque algunas combinaciones exhiben una relación indiferente. Es importante destacar que ninguna de las combinaciones mostró signos de ser antagónicas (Tabla 6).

Recientemente hemos demostrado que la actividad antimicrobiana de la bacteriocina PLNC8 αβ contra Staphylococcus spp. es óptima cuando los péptidos α y β se usan juntos en una proporción molar de 1:114. PLNC8 αβ es una bacteriocina eficaz y valiosa contra bacterias grampositivas; sin embargo, sería ventajoso desarrollar péptidos cortos y optimizados de PLNC8 αβ con actividad de amplio espectro para atacar también infecciones desafiantes causadas por bacterias gramnegativas. PLNC8 β, pero no PLNC8 α, mostró actividad lítica en liposomas y contra bacterias, pero no fue suficiente para inhibir el crecimiento bacteriano. Por tanto, el desarrollo de péptidos antimicrobianos cortos y optimizados se basó en la secuencia de aminoácidos de PLNC8 β.

Pudimos identificar y desarrollar varios compuestos nuevos que exhiben una alta actividad antimicrobiana in vitro, incluso en dosis muy bajas. Chu-Kung y sus colegas27 mostraron una mayor actividad antimicrobiana de los péptidos después de la conjugación de ácido láurico (cadena FA con un esqueleto de 12 átomos de carbono). Por tanto, nuestros resultados en la obtención de una actividad antimicrobiana significativamente mejorada después de la conjugación de una cadena corta de FA (cinco a siete átomos de carbono) son sorprendentes. Laverty et al., 201031 analizaron una variedad de lipopéptidos con diferentes longitudes de AG y demostraron que la actividad antimicrobiana mejoraba al aumentar la longitud de la cadena de AG. La variante más eficaz comprendía una cadena FA con 12 átomos de carbono, lo que concuerda con los resultados obtenidos por Chu-Kung y colegas27. Sin embargo, se demostró que este lipopéptido es altamente hemolítico y citotóxico en concentraciones ≥ 50 µg/ml, lo que produce una hemólisis completa. Nuestros resultados también mostraron una mayor actividad hemolítica con una mayor longitud de FA, pero dado que la actividad antibacteriana se redujo en nuestros lipopéptidos con cadenas de FA compuestas de 8 carbonos o más, los lipopéptidos conjugados con la cadena de FA más corta de 5 a 7 carbonos se consideraron los principales. candidatos para un examen más detallado. Además, los enantiómeros D de 6-C5, 6-C6 y 6-C7 mostraron una mayor actividad antimicrobiana contra S. aureus y E. coli, lo que probablemente se debe a la resistencia contra la degradación proteolítica. Se pudo observar la misma tendencia para los patógenos ESKAPE, donde los enantiómeros D mostraron una mejor actividad que los enantiómeros L, especialmente para K. pneumoniae, P. aeruginosa y E. cloacae. La diferencia más destacada se observó en E. cloacae, donde la concentración más alta de los enantiómeros L analizados (100 µM) no fue suficiente para inhibir y matar completamente a las bacterias, lo que sugiere una mayor actividad proteolítica entre algunas de estas cepas, lo cual está en línea con patogenicidad y resistencia reportadas entre aislados clínicos de los patógenos ESKAPE.32.

Además, la sustitución de isoleucina por leucina mejoró aún más la actividad antimicrobiana del lipopéptido. Como se menciona en los resultados, la leucina tiene una mayor propensión a la formación de hélices α que la isoleucina, lo que podría ser parte de la explicación del aumento de la actividad, aunque no se observó ningún cambio significativo en la estructura secundaria. Además, se ha informado anteriormente que la sustitución única de leucina por isoleucina o viceversa altera la función de las proteínas y los anticuerpos33,34, lo que podría explicar el aumento de la actividad antimicrobiana observada en nuestros resultados, pero el mecanismo exacto aún está por determinar. Estos resultados indican que el péptido no reconoce ni se une a moléculas diana específicas, por ejemplo, proteínas y glicoproteínas en la superficie bacteriana, lo que sugiere que la unión inicial es impulsada por interacciones electrostáticas con estructuras bacterianas aniónicas, como los lípidos de membrana, que de hecho es una de los mecanismos de acción comunes en los AMP35. Aunque los mecanismos precisos aún no se han determinado, incluidas las interacciones iniciales con la pared celular bacteriana (grampositivas) o la membrana externa (gramnegativas), la rápida permeabilización indica que el objetivo final y principal de los lipopéptidos son, de hecho, las membranas bacterianas.

Los estudios de dispersión dinámica de la luz permitieron resaltar el papel de la agregación de lipopéptidos en el proceso de permeabilización de la membrana bacteriana. La agregación de los lipopéptidos L-6, L-6-C2, L-6-C5 y L-6-C7 se evaluó en tampón, demostrando una disminución en la concentración crítica de agregación (CAC) con un aumento en la longitud de la cola de carbono, con CAC correspondientes a 10 µM, 8 µM, 5,6 µM y 0,8 µM, respectivamente (Fig. 4 BF). Al comparar los valores de CAC con MBC, encontramos que este último es más alto que el CAC contra ambos S. aureus grampositivos (> 100 μM, 100 μM, 6,2 μM y 3,1 μM en relación con los lipopéptidos L-6, L-6-C2 , L-6-C5 y L-6-C7, respectivamente) y E. coli gramnegativas (> 100 μM, 50 μM, 6,2 μM y 6,2 μM, en relación con los lipopéptidos L-6, L-6-C2, L-6-C5 y L-6-C7 respectivamente). Estos hallazgos indican fuertemente que la formación de agregados de lipopéptidos contribuye a su actividad antimicrobiana.

Aunque aún se desconoce el mecanismo de acción exacto, se pueden sacar algunas conclusiones. Es bien sabido que los lipopéptidos interactúan y se organizan espontáneamente, formando estructuras similares a micelas debido a su naturaleza anfifílica36,37. La fuerza impulsora inicial para la asociación con la membrana bacteriana está representada por la interacción electrostática, como se mencionó anteriormente. La atracción entre los residuos catiónicos (Arg y Lys, en las posiciones 13 y 4, 11, 14 respectivamente) y los grupos fosfato cargados negativamente de la membrana bacteriana estabilizan las interacciones mediante enlaces de hidrógeno37,38. Un segundo evento que impulsa la asociación de lipopéptidos con la membrana bacteriana está constituido por el efecto hidrofóbico y las interacciones de van der Waals entre las cadenas de acilo de lipopéptidos y el núcleo hidrofóbico de la membrana bacteriana, lo que resulta en la partición de la membrana lipídica. Atribuido a un empaquetamiento micelar deficiente36 o a la alteración ordenada de las mismas como consecuencia de la unión inicial de la membrana micela37, las colas lipídicas expuestas quedan disponibles para la interacción, lo que resulta en la disociación agregada y la inserción de lipopéptidos en la bicapa lipídica. Aunque todavía se desconoce si los agregados o los lipopéptidos individuales contribuyen más a la lisis celular, parece seguro que la acumulación de agregados en la superficie de la membrana bacteriana aumenta drásticamente la concentración local de lipopéptidos, lo que resulta en una alteración eficiente de la membrana38. Como lo indica la espectroscopia de CD, estas interacciones no desencadenaron ningún cambio en la estructura secundaria de los lipopéptidos, que por lo demás es muy común para los AMP.

Además de su capacidad inherente para matar bacterias o inhibir el crecimiento bacteriano, los péptidos antimicrobianos que se dirigen a las membranas bacterianas también son candidatos atractivos para su uso en combinación con antibióticos más convencionales para aumentar su eficacia y suprimir el desarrollo y la propagación de la resistencia a los antimicrobianos. Se ha demostrado que la nisina actúa sinérgicamente con el ácido cítrico39, la penicilina y el cloranfenicol40 contra varias especies de Staphylococcus. Anteriormente hemos demostrado que la plantaricina A, E, F, J, K41 y NC8 αβ14 mejoran sustancialmente los efectos de varios antibióticos, incluidos vancomicina, teicoplanina, rifampicina, gentamicina y tetraciclina, contra especies de Staphylococcus. Nuestros resultados sugieren además que los nuevos lipopéptidos presentados aquí también pueden usarse en combinación con antibióticos. Se ha utilizado la terapia combinada para reducir la concentración requerida de antibióticos y, en consecuencia, reducir posibles efectos secundarios, contaminaciones ambientales y desarrollo de resistencia.

La facilidad con la que las bacterias pueden desarrollar resistencia a los antibióticos es una de las razones por las que en las últimas décadas se han puesto a disposición tan pocas clases nuevas de antibióticos para uso clínico. Muy pocas grandes empresas farmacológicas siguen activas en el campo del descubrimiento de antibióticos, un campo que hoy en día se desarrolla principalmente en laboratorios académicos más pequeños. La razón es principalmente una cuestión financiera; Debido a los riesgos asociados con el desarrollo de resistencia a nuevos compuestos antibióticos, el campo de los antibióticos no es tan rentable como otros campos del desarrollo de fármacos42,43. Aunque los riesgos de desarrollo de resistencia bacteriana a los AMP se han considerado pequeños durante mucho tiempo, algo que ha sido un factor que ha contribuido al mayor interés en la investigación sobre los AMP, los informes sobre la resistencia a los AMP están aumentando. Algunos de los mecanismos bacterianos de resistencia a los AMP incluyen el uso de enzimas proteolíticas y alteraciones de la membrana que resultan en un cambio en la carga neta, limitando así la capacidad del péptido para interactuar con la membrana44. Por lo tanto, es necesario considerar la posibilidad de que se desarrollen resistencias también en la investigación sobre los AMP. Nuestros resultados no mostraron indicios de desarrollo de resistencia en ninguna de las bacterias analizadas, cuando se expusieron a concentraciones sub-MIC del lipopéptido durante 30 pases, lo que nuevamente sugiere que las membranas lipídicas conservadas evolutivamente de las bacterias constituyen el objetivo del péptido. Como se mencionó anteriormente, el uso de enantiómeros D también puede ser una estrategia para combatir la degradación por proteasas, aunque no está claro cómo esto podría afectar la toxicidad y la acumulación, especialmente considerando la administración sistémica. Sin embargo, con el tiempo suficiente es probable que se desarrolle cierta resistencia y, como ocurre con todas las sustancias antibacterianas, se debe tener cuidado para evitar una exposición innecesaria.

Si bien en las últimas décadas se han identificado numerosos péptidos antimicrobianos diferentes con excelentes efectos in vitro, pocos han llegado a la práctica clínica debido a limitaciones como la susceptibilidad proteolítica, la citotoxicidad, la escasa biodisponibilidad y la sensibilidad contextual, y aquellos que de hecho se han fabricado clínicamente disponibles están formulados con mayor frecuencia para uso tópico45. Por lo tanto, las modificaciones de los AMP mediante bioingeniería, como las exploradas en este artículo, se han vuelto cada vez más relevantes para superar dichas limitaciones y hacer que los AMP sean más adecuados para uso farmacológico46. Si bien se requiere más investigación para determinar el uso terapéutico potencial de estos nuevos lipopéptidos, donde los estudios in vivo de la toxicidad y actividad de los lipopéptidos son de especial importancia, la selectividad de los lipopéptidos hacia las membranas bacterianas frente a las membranas de los mamíferos es un aspecto prometedor.

En conclusión, hemos llevado a cabo un proceso de diseño racional para identificar una pequeña biblioteca de nuevos lipopéptidos derivados de Plantaricin NC8 αβ. Los lipopéptidos exhiben una actividad antibacteriana eficaz tanto contra bacterias grampositivas como gramnegativas incluso en concentraciones micromolares. Al tomar en consideración la actividad hemolítica y la CE50 presentada anteriormente, y las similitudes relativas en la actividad antimicrobiana entre los compuestos suplementados con cadenas de FA de 5 a 7 átomos de carbono, sugerimos que los compuestos conjugados con una cola de FA de 5 átomos de carbono (6 -C5 y 6-C5-Leu) son de mayor interés para futuras investigaciones. Además, los métodos para la identificación y diseño de estos lipopéptidos empleados en este estudio proporcionan vías adicionales a seguir en el desarrollo de nuevos compuestos antimicrobianos. Si bien PLNC8 αβ sigue siendo un candidato farmacéutico interesante, en particular para el tratamiento de infecciones causadas por Staphylococcus spp., los lipopéptidos presentados aquí tienen varios beneficios. Mientras que PLNC8 αβ tiene una solubilidad limitada y tiende a precipitar en condiciones fisiológicas (datos no publicados), los lipopéptidos forman conjuntos coloidalmente estables. Además, en comparación con PLNC8 αβ, que es una bacteriocina de dos péptidos que comprende un péptido α y β con 29 y 34 residuos, respectivamente47, los lipopéptidos son menos complejos. Sin embargo, la actividad antibacteriana de estos lipopéptidos es significativamente mayor que la de PLNC8 αβ y son eficaces tanto contra bacterias grampositivas como gramnegativas, lo cual es un atributo muy deseado para cualquier compuesto antibacteriano nuevo.

Los conjuntos de datos generados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles a través de los autores correspondientes previa solicitud.

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Este trabajo fue apoyado por la Fundación Sueca para la Investigación Estratégica (SSF), RMX18 0039 y la Knowledge Foundation, 20180148.

Financiamiento de acceso abierto proporcionado por la Universidad de Örebro.

Facultad de Ciencias Médicas, Facultad de Medicina y Salud, Departamento de Microbiología, Inmunología y Ciencias de la Reproducción, Universidad de Örebro, Örebro, Suecia

Emanuel Wiman, Torbjörn Bengtsson y Hazem Khalaf

Laboratorio de Materiales Moleculares, División de Biofísica y Bioingeniería, Departamento de Física, Química y Biología, Universidad de Linköping, 581 83, Linköping, Suecia

Elisa Zattarin, Daniel Aili y Robert Selegård

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HK y TB contribuyeron a la concepción y diseño del estudio; EW, EZ, RS y HK contribuyeron a la adquisición y análisis de datos; EW, EZ, RS, DA, TB y HK interpretaron los datos; EW y EZ escribieron el primer borrador del manuscrito; RS y HK escribieron secciones del manuscrito; HK, TB, RS y DA revisaron el borrador original del manuscrito. Todos los autores contribuyeron a la revisión del manuscrito, leyeron y aprobaron la versión enviada.

Correspondencia a Robert Selegård o Hazem Khalaf.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Wiman, E., Zattarin, E., Aili, D. et al. Desarrollo de nuevos lipopéptidos antimicrobianos de amplio espectro derivados de plantaricina NC8 β. Representante científico 13, 4104 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-31185-8

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Recibido: 22 de noviembre de 2022

Aceptado: 07 de marzo de 2023

Publicado: 13 de marzo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-31185-8

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